郭長義 蔣宗勇 李 職 林映才 蔣守群 馬現(xiàn)永 鄭春田

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所,農(nóng)業(yè)部動物營養(yǎng)與飼料（華南）重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,廣東省動物育種與營養(yǎng)公共實(shí)驗(yàn)室,廣州 510640;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,廣州 510642;3.比利美英偉營養(yǎng)飼料（深圳）有限公司,深圳 518103）

精氨酸作為一種堿性氨基酸,在動物體內(nèi)除參與體蛋白質(zhì)沉積外,還通過多種酶,如精氨酸酶、一氧化氮合成酶、精氨酸-甘氨酸轉(zhuǎn)脒酶以及精氨酸脫羧酶催化后廣泛參與機(jī)體代謝,并通過其代謝物在動物體內(nèi)發(fā)揮著重要營養(yǎng)生理效應(yīng)[1-3],這提示其在豬營養(yǎng)研究中有潛在的應(yīng)用價(jià)值。母豬飼糧精氨酸水平升高對哺乳仔豬生長有顯著的促進(jìn)作用[4-5],外源精胺與胰島素樣生長因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）等成分對仔豬小腸黏膜發(fā)育具有刺激作用[6-11],乳中精胺和IGF-Ⅰ的含量隨泌乳母豬飼糧精氨酸水平升高而顯著升高[12]。本試驗(yàn)旨在研究母豬飼糧精氨酸水平對哺乳仔豬腸道發(fā)育的影響,借以闡明提高母豬飼糧精氨酸水平促進(jìn)哺乳仔豬生長的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選擇遺傳一致,2～4胎、體重、膘情和預(yù)產(chǎn)期相近的長大二元雜交經(jīng)產(chǎn)母豬36頭,于妊娠110 d左右進(jìn)入產(chǎn)房,隨機(jī)分為0.82%精氨酸組（n=12）、1.23%精氨酸組（n=12）和1.64%精氨酸組（n=12）3個(gè)組。各組泌乳母豬飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。飼糧精氨酸水平分別為0.82%、1.23%和1.64%,添加L-精氨酸鹽酸鹽使飼糧精氨酸含量達(dá)到需要的值,添加L-丙氨酸平衡飼糧以保持各組飼糧等氮,其他營養(yǎng)含量均滿足或超過NRC（1998）推薦量。L-精氨酸鹽酸鹽產(chǎn)自湖北省潛江市四維氨基酸有限公司,食品級,純度為99.7%,含82%的精氨酸。試驗(yàn)從產(chǎn)后第4天開始至第22天斷奶時(shí)結(jié)束。

表1 泌乳母豬飼糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Table 1 Com position and nutrient leve ls of lac tating sow diets（air-d ry basis,%）

1.2 飼養(yǎng)管理

母豬分娩當(dāng)天作為產(chǎn)后第1天,18:00以后分娩的按次日計(jì)算,仔豬隨母豬飼養(yǎng)在帶有保溫設(shè)施的高床產(chǎn)房里。母豬產(chǎn)后最初幾天采用定量限飼的方式進(jìn)行飼喂,其中第1天、第2天和第3天分別飼喂0.7、1.4和2.1 kg飼糧,第4天和第5天分別飼喂3.1和4.1 kg飼糧,第6天以后自由采食。每日飼喂2次,自由飲水。母豬產(chǎn)后48 h內(nèi)調(diào)整母豬窩仔數(shù)達(dá)到10頭,并于產(chǎn)后第4天清晨根據(jù)仔豬體重進(jìn)行調(diào)整,保證各組母豬所帶仔豬重量基本一致,試驗(yàn)期間仔豬不補(bǔ)料。

1.3 樣品收集和處理

仔豬21日齡斷奶,斷奶當(dāng)日清晨,每組選6頭接近平均體重的仔豬,共18頭。參照秦江帆[13]的方法,所選仔豬屠宰后,切開腹腔取出全部小腸,迅速置入放有雙抗的冰凍PBS溶液中。剪開腸系膜,將腸段打開,分別取十二指腸、空腸、回腸各2段,每段2～3 cm。其中1段放入10%的福爾馬林固定液中,以備光鏡觀察;另外1段放入PBS液中,洗凈后剪成5 mm左右的小塊,放入裝有4%戊二醛固定液的小瓶中,以備電鏡觀察。

接著再取各腸段（十二指腸、空腸、回腸）,剪成5 cm的小段,剖開腸管,冰凍PBS液沖洗干凈后,用定性濾紙將黏膜表面的PBS液吸干,用載玻片將腸黏膜輕輕地刮下來,1.5 m L離心管分裝后液氮保存,待測。

1.4 測定指標(biāo)與方法

1.4.1 哺乳仔豬小腸黏膜絨毛結(jié)構(gòu)的光鏡和電鏡觀察

光鏡觀察前,取出組織樣,經(jīng)修整、水洗、脫水、浸蠟、包埋、切片、貼片、烤片,蘇木精-伊紅染色,光鏡下觀察并拍照。利用JD801形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng),統(tǒng)計(jì)小腸黏膜絨毛高度及隱窩深度。

電鏡觀察前,取出組織塊,用PBS漂洗3次,每次15min,然后用1%鋨酸固定1 h,再次用PBS漂洗3次,每次10 m in。接下來用酒精梯度脫水（50%、70%、80%、90%、100%）各2次,每次10 min。100%酒精第2次脫水后加入無水硫酸銅,再用醋酸正戊酯轉(zhuǎn)化2次,每次15 m in,CO2臨界點(diǎn)干燥。裝臺,粘樣,IB-5離子濺射儀噴金,用XL30ESEM電鏡掃描,觀察并拍照。

1.4.2 哺乳仔豬小腸黏膜組織預(yù)處理

取組織樣0.4 g,加3.6m L預(yù)冷PBS液,組織勻漿器間歇性勻漿40～60 s（以上操作在冰浴中完成）。離心（4℃,3 000 r/m in,10 m in）,取上清液即為10%組織勻漿上清液,備測。

1.4.3 哺乳仔豬小腸黏膜組織蛋白質(zhì)含量的測定

考馬斯亮藍(lán)染色法測定蛋白質(zhì)含量,試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.4.4 哺乳仔豬小腸黏膜組織乳糖酶與堿性磷酸酶活性的測定

乳糖酶與堿性磷酸酶活性采用試劑盒測定,試劑盒購自南京建成生物工程研究所,根據(jù)說明書進(jìn)行操作。

1.4.5 哺乳仔豬小腸黏膜組織谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量的測定

GSH-Px、SOD活性和MDA含量采用試劑盒測定,試劑盒購自南京建成生物工程研究所,根據(jù)說明書進(jìn)行操作。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理方法

全部數(shù)據(jù)采用SAS 8.1 GLM程序進(jìn)行方差分析,用Duncan氏法進(jìn)行多重比較,并進(jìn)行回歸分析,設(shè)定P＜0.05為差異顯著。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SE）表示。

2 結(jié) 果

2.1 泌乳母豬飼糧精氨酸水平對哺乳仔豬小腸黏膜絨毛形態(tài)的影響

表2結(jié)果顯示,哺乳仔豬各腸段黏膜絨毛高度均隨泌乳母豬飼糧精氨酸水平升高而升高,其中十二指腸黏膜絨毛高度與泌乳母豬飼糧精氨酸水平呈線性相關(guān),其回歸方程為:y=50.166x+549.06 （r=0.49,P＜0.05）;各組間空腸和回腸黏膜絨毛高度差異均不顯著（P＞0.05）。哺乳仔豬各腸段黏膜隱窩深度均隨泌乳母豬飼糧精氨酸水平升高而下降,十二指腸、空腸和回腸黏膜隱窩深度均與泌乳母豬飼糧精氨酸水平呈線性相關(guān),其回歸方程依次為:y=-17.083x+204.184（r=0.47,P＜0.05）,y= -37.961x+186.044（r=0.56,P＜0.05）,y= -51.602x+188.168（r=0.57,P＜0.05）。

表2 泌乳母豬飼糧精氨酸水平對哺乳仔豬小腸絨毛高度和隱窩深度的影響Table 2 Effects of dietary arginine levels of lactating sows on the villous height and crypt depth of sm all intestine in suck ling piglets（μm）

由圖1至圖3可以看出,隨母豬飼糧精氨酸水平的升高,十二指腸黏膜絨毛密集度趨于增加,空腸黏膜整齊度改善,回腸無明顯變化。

2.2 泌乳母豬飼糧精氨酸水平對哺乳仔豬小腸黏膜乳糖酶和堿性磷酸酶活性的影響

如表3所示,哺乳仔豬各腸段黏膜乳糖酶活性均隨泌乳母豬飼糧精氨酸水平升高而升高,其中十二指腸和空腸黏膜乳糖酶活性與泌乳母豬飼糧精氨酸水平呈線性相關(guān),其回歸方程分別為:y=23.5x+ 135.846（r=0.56,P＜0.05）;y=34.939x+ 113.638（r=0.58,P＜0.05）;各組間回腸黏膜乳糖酶活性差異不顯著（P＞0.05）。哺乳仔豬各腸段黏膜堿性磷酸酶活性均隨泌乳母豬飼糧精氨酸水平升高而升高,其中十二指腸和空腸黏膜堿性磷酸酶活性與泌乳母豬飼糧精氨酸水平呈線性相關(guān),其回歸方程分別為:y=43.162x+262.809（r=0.56,P＜0.05）,y=48.537x+249.178（r=0.50,P＜ 0.05）。各組間回腸黏膜堿性磷酸酶活性差異不顯著（P＞0.05）。

表3 泌乳母豬飼糧精氨酸水平對哺乳仔豬小腸黏膜乳糖酶和堿性磷酸酶活性的影響Table 3 Ef fec ts o f dietary arginine levels of lactating sows on lactase and alkaline phosphatase activities of small intestinalmucosa in suck ling piglets（U/g prot）

2.3 泌乳母豬飼糧精氨酸水平對哺乳仔豬小腸黏膜GSH-Px、SOD活性和MDA含量的影響

如表4所示,哺乳仔豬十二指腸、空腸和回腸黏膜GSH-Px活性均隨泌乳母豬飼糧精氨酸水平升高而升高,并且呈線性相關(guān),其回歸方程依次為:y= 5.914x+10.884（r=0.82,P＜0.05）;y=3.84x+ 10.667（r=0.53,P＜0.05）;y=2.015x+11.587 （r=0.56,P＜0.05）。哺乳仔豬各腸段黏膜SOD活性均隨泌乳母豬飼糧精氨酸水平升高而升高,并且呈線性相關(guān),其回歸方程依次為:y=2.173x+ 12.633（r=0.68,P＜0.05）;y=1.561x+12.463 （r=0.53,P＜0.05）;y=1.53x+10.394（r= 0.48,P＜0.05）。哺乳仔豬各腸段MDA含量均隨泌乳母豬飼糧精氨酸水平升高而降低,其中十二指腸和空腸黏膜MDA含量與泌乳母豬飼糧精氨酸水平呈線性相關(guān),其回歸方程依次為:y=-0.231x+ 0.913（r=0.61,P＜0.05）;y=-0.246x+0.924 （r=0.61,P＜0.05）;各組間回腸黏膜MDA含量差異不顯著（P＞0.05）。

表4 泌乳母豬飼糧精氨酸水平對哺乳仔豬小腸黏膜GSH-Px、SOD活性和M DA含量的影響Tab le 4 Effects of dietary arginine levels of lac tating sows on GSH-Px,SOD activities and MDA content o f small intestinalmucosa in suck ling piglets

3 討 論

3.1 泌乳母豬飼糧精氨酸水平對哺乳仔豬小腸黏膜絨毛形態(tài)的影響

小腸絨毛是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要部位,其絨毛高度變化顯示小腸上皮細(xì)胞的功能狀況,而隱窩深度則顯示上皮細(xì)胞的增殖狀況,這2個(gè)形態(tài)學(xué)指標(biāo)作為仔豬小腸發(fā)育和成熟的主要標(biāo)志被廣泛研究和采用[14-15]。此外,通過電鏡觀察可以更為直觀地對小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性和發(fā)育程度進(jìn)行觀察。

本研究對哺乳仔豬小腸黏膜絨毛高度與隱窩深度進(jìn)行了分析測定,結(jié)果表明,增加泌乳母豬飼糧精氨酸水平可以提高哺乳仔豬小腸黏膜絨毛高度,同時(shí)降低其隱窩深度。該結(jié)果提示,提高泌乳母豬飼糧精氨酸水平能夠增加哺乳仔豬小腸黏膜成熟細(xì)胞的數(shù)量和小腸黏膜的表面積,有效促進(jìn)哺乳仔豬小腸發(fā)育和成熟。電鏡觀察顯示,與0.82%精氨酸組相比,1.23%和1.64%精氨酸組哺乳仔豬小腸黏膜絨毛多而整齊,提示其有更好的發(fā)育狀態(tài)。究其原因,可能與乳中包括精胺與IGF-Ⅰ在內(nèi)的多種活性分子含量增加有關(guān),后者能促進(jìn)哺乳仔豬小腸發(fā)育和成熟。程志斌[11]報(bào)道仔豬口服精胺能夠增加小腸重量,提高空腸和回腸黏膜蛋白質(zhì)含量以及DNA、RNA濃度。Buts等[16]報(bào)道口服精胺可以增加大鼠小腸長度和重量,提高黏膜重量和DNA含量。腐胺可以為小腸提供能量,并且已經(jīng)證實(shí)腐胺對小腸發(fā)育的影響是間接效應(yīng),即外源腐胺進(jìn)入小腸黏膜上皮細(xì)胞后代謝為精脒和精胺,進(jìn)而促進(jìn)小腸成熟[17-19]。除此之外,口服IGF-Ⅰ能顯著增加仔豬小腸重量、DNA和RNA濃度以及空腸和回腸絨毛高度[9-10],并能提高仔豬小腸吸收養(yǎng)分的能力[6-8]。

3.2 泌乳母豬飼糧精氨酸水平影響哺乳仔豬小腸黏膜機(jī)能的作用機(jī)理

小腸是動物體內(nèi)最重要的消化器官,其中消化酶活性最能反映其消化機(jī)能。較早對小腸消化酶活性發(fā)育的研究,主要以黏膜層消化酶活性變化為衡量指標(biāo),其原因之一是小腸乳糖酶、麥芽糖酶和堿性磷酸酶等水解酶主要定位于絨毛刷狀緣,而并不分泌至腸腔[20-22]。母乳是新生仔豬唯一的食物來源,而乳糖是母乳中最為重要的碳水化合物,因此乳糖酶的成熟對新生仔豬消化機(jī)能顯得特別重要。腸上皮細(xì)胞刷狀緣分布的堿性磷酸酶主要作用是催化多種磷酸單酯的水解,此外還與分泌型免疫球蛋白（SIgA）、杯狀細(xì)胞分泌的黏液組成動物與外界的一層屏障,阻止絕大多數(shù)外來致病原侵入。因此檢測小腸黏膜乳糖酶和堿性磷酸酶的活性可以在一定程度上反映小腸黏膜的消化機(jī)能。本研究對哺乳仔豬小腸黏膜中的乳糖酶和堿性磷酸酶活性進(jìn)行了分析測定,結(jié)果表明,增加泌乳母豬飼糧精氨酸水平能夠提高哺乳仔豬小腸黏膜乳糖酶和堿性磷酸酶的活性。鑒于已有的報(bào)道均表明口服精胺降低乳糖酶的活性[11,16],因此本試驗(yàn)中乳糖酶活性的提高原因可能是由于母豬飼糧精氨酸通過影響母乳中IGF-Ⅰ等活性成分,刺激了腸腺的發(fā)育與成熟,從而增強(qiáng)了該酶的活性,為仔豬有效消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)提供支持。Young等[23]報(bào)道IGF-Ⅰ可提高大鼠腸黏膜乳糖酶的活性。H artke等[24]研究發(fā)現(xiàn),給仔豬口服IGF-Ⅰ可以使乳糖酶水解酶活性增加18%,蔗糖酶活性增加45%。H oule等[10]報(bào)道,初生仔豬每天攝入200mg/kg重組人IGF-Ⅰ,7 d后在近端和中端回腸乳糖酶活性提高2倍,蔗糖酶活性提高50%。

小腸上皮細(xì)胞在新陳代謝過程中,會不斷產(chǎn)生活性氧代謝物——自由基,當(dāng)自由基產(chǎn)生過多時(shí),超過機(jī)體清除氧自由基的能力,即誘發(fā)氧化應(yīng)激,引起脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA的過氧化,最終導(dǎo)致組織、器官的損傷[25]。小腸對氧自由基的損傷極為敏感,腸黏膜含有高濃度的非蛋白質(zhì)巰基,氧自由基作用于巰基使蛋白質(zhì)變性、酶失活,氧自由基與膜內(nèi)多不飽和脂肪酸結(jié)合造成脂質(zhì)過氧化損害,損傷腸黏膜組織,這種損傷不僅降低腸細(xì)胞的吸收能力,還將導(dǎo)致膜的通透性加大,造成腸道細(xì)菌和內(nèi)毒素移位,病原菌侵入的增加,使得巨噬細(xì)胞在吞噬過程中釋放活性氧數(shù)量增加,生成的O2-可使酶類及非酶類的物質(zhì)還原并可產(chǎn)生反應(yīng)性更高的活性氧[26]。SOD和GSH-Px是重要的抗氧化系統(tǒng)成員,能清除超氧陰離子自由基（AOR）,保護(hù)細(xì)胞免受損傷[27-30]。脂質(zhì)過氧化物MDA是由活性氧以及由之觸發(fā)的脂質(zhì)過氧化的終末產(chǎn)物,反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度,間接地反映出細(xì)胞損傷的程度[31]。因此,檢測SOD、GSH-Px的活性和MDA的含量,可以反映機(jī)體清除自由基的能力及細(xì)胞受損的嚴(yán)重程度。本試驗(yàn)分別對小腸黏膜GSH-Px、SOD活性和MDA含量進(jìn)行了檢測,結(jié)果表明,與0.82%精氨酸組相比, 1.23%和1.64%精氨酸組哺乳仔豬小腸GSH-Px和SOD活性明顯升高,而MDA含量有所下降,說明泌乳母豬飼糧精氨酸水平升高增強(qiáng)了哺乳仔豬小腸黏膜抗氧化保護(hù)能力,其機(jī)理可能與乳中精胺和IGF-Ⅰ含量增加有關(guān)。Farbiszewski等[32-33]研究證實(shí)精胺對機(jī)體抗氧化酶有保護(hù)作用,而García-Fernández等[34-35]也發(fā)現(xiàn)IGF-Ⅰ能夠減少自由基對機(jī)體的氧化損傷。盡管目前尚未見到乳源精胺和IGF-Ⅰ改善仔豬腸道抗氧化機(jī)能的報(bào)道,但本試驗(yàn)結(jié)果一定程度上說明了提高泌乳母豬飼糧精氨酸水平,可以通過增加乳中精胺和IGF-Ⅰ的含量來改善哺乳仔豬體內(nèi)如小腸黏膜抗氧化機(jī)能,進(jìn)而促進(jìn)小腸黏膜的正常發(fā)育。

4 結(jié) 論

①提高泌乳母豬飼糧精氨酸水平改善了哺乳仔豬小腸黏膜絨毛高度,降低了隱窩深度。

②提高泌乳母豬飼糧精氨酸水平顯著提高哺乳仔豬小腸黏膜乳糖酶和堿性磷酸酶的活性,增加哺乳仔豬小腸黏膜GSH-Px和SOD活性,降低MDA含量。

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*Correspond ing au thor,p rofessor,E-m ail:jiangz38@hotmail.com

（編輯 田艷明）