微生物β-半乳糖苷酶的研究進展

劉芳寧，梁 琪，張 炎，張衛(wèi)兵*

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

乳糖酶（β-galactosidase）是一種無毒無副作用的生物酶制劑，國際生化編號EC3.2.1.23。其能夠催化β-半乳糖苷化合物中β-半乳糖苷鍵發(fā)生水解，還具有轉(zhuǎn)半乳糖苷的作用。目前，乳糖酶的應(yīng)用領(lǐng)域很廣。在乳品工業(yè)中，乳糖酶可用于生產(chǎn)低乳糖制品和低聚半乳糖[1]。在乳品加工中，采用乳糖酶水解乳糖，可以避免冷凍濃縮乳制品中乳糖的結(jié)晶、乳清析出等問題。在酸奶的生產(chǎn)中，可加速酸化反應(yīng)和提高發(fā)酵效率，使酸奶具有特有的乳香風(fēng)味。在干酪生產(chǎn)中，可以加速干酪的成熟[2]。在分析方面，將葡萄糖氧化酶和乳糖酶聯(lián)合使用制備生物傳感器，直接測定牛乳等乳制品中乳糖的含量，該法簡便快捷，費用低廉[3]。在環(huán)境保護方面，乳糖酶可以分解乳清中的乳糖，減緩乳清排放后較高的生物需氧量對水造成的污染[4]。其他方面，乳糖酶與桃果實成熟前期果實的軟化啟動密切相關(guān)，能促進其成熟及軟化[5]。

關(guān)于乳糖酶的研究，國外學(xué)者從20世紀(jì)60年代開始研究，已成功地找到產(chǎn)乳糖酶的微生物，并研制了一系列乳糖酶商品，現(xiàn)已投入市場，如荷蘭帝斯曼公司生產(chǎn)的商品名為Maxilact的乳酸克魯維酵母乳糖酶；美國紐約酶發(fā)展公司生產(chǎn)的來源于黑曲霉的Fungal lactase等。近幾十年國內(nèi)對乳糖酶的研究也成為了熱點，我國對乳糖酶的研究主要集中在產(chǎn)酶菌株的篩選，產(chǎn)酶條件的優(yōu)化，酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究等方面，哈爾濱美華生物技術(shù)股份有限公司的脆壁克魯維酵母中性乳糖酶已經(jīng)面世，但我國乳糖酶的產(chǎn)量低限制了其在乳品工業(yè)中的應(yīng)用。由此可見，研究開發(fā)乳糖酶新產(chǎn)品將為我國乳糖酶的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)和乳品工業(yè)的飛速發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 乳糖酶的來源

乳糖酶的天然來源十分豐富，包括多種動物、植物、微生物。乳糖酶廣泛存在于桃、杏、蘋果和咖啡豆等植物中，豌豆、苜蓿、高粱、玉米的根尖組織能在酸性環(huán)境中分泌乳糖酶[6]。動物來源主要有腸、腦等器官和皮膚組織。

基于微生物的快速生長、高效代謝和易于控制等特性和微生物乳糖酶源豐富、性質(zhì)多樣、生產(chǎn)成本低、周期短，而且不受季節(jié)、地理位置等因素的影響的優(yōu)勢，產(chǎn)乳糖酶的微生物備受人們關(guān)注。微生物乳糖酶的來源主要有細(xì)菌、酵母、霉菌。細(xì)菌來源的乳糖酶的種類較多，其中包括大腸桿菌（Escherichia coli）、環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus Circulans）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus）、凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）、卷曲乳桿菌（Lactobacillus crispatus）、長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）、德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckiissp.bulgaricus）等；產(chǎn)乳糖酶的酵母主要有乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）、脆壁克魯維酵母（Kluyveromyces fragilis）、馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）、偽熱帶念珠酵母（Candida pseudotropicalis）、普魯蘭久浩酵母（Guehomyces pullulans）等；目前應(yīng)用較多的霉菌乳糖酶產(chǎn)生菌主要是米曲霉（Aspergillus oryzae）和黑曲霉（Aspergillus niger），亮白曲霉（Aspergillus candidus）、產(chǎn) 黃 青 霉（Penicillium chrysogenum）、炭黑曲霉（Aspergillus carbonarius）等也能產(chǎn)生乳糖酶[7-8]。但是應(yīng)用于食品工業(yè)的酶必須符合FDA的GRAS（generally regarded as safe）的要求。現(xiàn)在商品化的乳糖酶都來源于微生物發(fā)酵法，基本上由酵母和霉菌發(fā)酵獲得。

2 微生物乳糖酶的分離純化

乳糖酶的分離和純化是研究其酶學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)。一般情況下希望酶有較高的純度，以避免其他酶（如蛋白酶）對酶的穩(wěn)定性造成影響。乳糖酶分離純化的過程一般包括預(yù)純化過程和層析分離2個過程。

2.1 預(yù)處理

微生物來源的乳糖酶有胞內(nèi)酶和胞外酶。在預(yù)處理中，產(chǎn)胞外酶的菌體的發(fā)酵液經(jīng)過離心沉淀菌體，上清液即為乳糖酶粗酶液；胞內(nèi)酶則需進行細(xì)胞破碎才能釋放乳糖酶。粗酶液的濃縮手段主要有：超濾、等電點沉淀法、硫酸銨鹽析沉淀法和有機溶劑沉淀等方法。

2.2 層析技術(shù)

表1 不同的層析方法聯(lián)合使用分離純化乳糖酶[10-14]Table 1 Purification of β-galactosidase by joint application of different chromatography method[10-14]

預(yù)處理之后，一般采用層析方法進一步分離以獲得高純度的乳糖酶。表1列舉了用不同的層析方法聯(lián)合使用分離純化乳糖酶的技術(shù)。從表1可以看出，乳糖酶的純化過程中，人們用的常規(guī)的方法有：離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析及疏水層析法等。由于酶蛋白來源的多樣性和復(fù)雜性，導(dǎo)致酶的分離純化沒有固定的方法，因此在分離純化過程中通常需要多種層析方法協(xié)同作用使酶得到純化。工藝次序及層析分離次序的選擇對純化倍數(shù)和回收率的影響是至關(guān)重要的，純化工藝次序的選擇策略為：（1）選擇不同機制的分離單元組成一套工藝；（2）將含量多的雜質(zhì)先分離去除；（3）盡早采用高效的層析分離手段，將最昂貴、最費時的分離單元放在最后階段[9]。

3 微生物來源的乳糖酶的特性

對乳糖酶生物學(xué)特性的研究，探索其規(guī)律特性，將為生產(chǎn)應(yīng)用提供切實可行的理論依據(jù)。微生物乳糖酶酶源豐富、性質(zhì)多樣主要表現(xiàn)在其最適溫度、最適pH值及其分子量等方面，表2列舉了不同微生物來源的乳糖酶的性質(zhì)。

表2 不同微生物來源的乳糖酶的特性Table 2 Characterization of microbial sources of β-galactosidase

3.1 細(xì)菌產(chǎn)生的乳糖酶

細(xì)菌乳糖酶最適pH值接近中性，具有易于發(fā)酵、酶的性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)勢，但由于安全性問題，在食品工業(yè)中的應(yīng)用受到了限制。細(xì)菌產(chǎn)生的乳糖酶大多為常溫乳糖酶，如大腸桿菌和卷曲乳桿菌ATCC33820乳糖酶的最適溫度分別為40℃、45℃[15-16]。但有些耐熱細(xì)菌乳糖酶的作用溫度較高，來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌乳糖酶最適溫度可達65℃，有些嗜冷菌乳糖酶的作用溫度較低，節(jié)桿菌乳糖酶最適溫度為10℃[10]。細(xì)菌產(chǎn)生的乳糖酶最適pH值近中性，一般為6.5～7.5，但節(jié)桿菌的最適pH值為8。

隨著人們對基因工程法提高乳糖酶產(chǎn)量的研究，多種來源的乳糖酶的基因已經(jīng)被克隆。細(xì)菌來源的乳糖酶基因大小和序列存在差異，但也有一定的同源性。Li對巨大芽孢桿菌2-37-4-1乳糖酶進行了純化，并對乳糖酶基因（bgaBM）進行了分析，該酶的分子量為120ku，bgaBM核苷酸序列開放閱讀框包含3105個bp，其編碼蛋白質(zhì)分子量為118ku[23]。乳酸球菌ATCC7962的乳糖酶的氨基酸序列與E.coli的相似性為46%，并且其催化酶活性的部位也含有Glu-429、Tyr-475[24]。嗜酸乳桿菌乳糖酶基因有l(wèi)acZ和lacLM，對lacZ基因進行了研究，表明該基因開放閱讀框含有2004個bp，編碼的乳糖酶的分子量為70ku[25]。來源于地衣芽孢桿菌的乳糖酶基因（lacA），其開放閱讀框包含2055個bp，可編碼684個氨基酸，其蛋白質(zhì)分子量為160ku（二亞基，80）。地衣芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌乳糖酶的氨基酸殘基相似性為76.6%，與產(chǎn)氣莢膜梭菌的相似性為47.9%，與環(huán)狀芽孢桿菌的相似性為36.9%，與嗜熱脂肪芽孢桿菌的相似性為35.6%，與噬棲熱菌的相似性為26.8%[26]。

3.2 酵母菌產(chǎn)生的乳糖酶

酵母所產(chǎn)乳糖酶最適pH值接近中性，被廣泛應(yīng)用于牛乳和乳清中乳糖的水解，但由于是胞內(nèi)酶，不易提取。沈為群等[14]研究表明，來源于乳酸克魯維酵母的乳糖酶最適作用pH值為6.4～6.8，最適溫度為40℃，其分子量為85ku，Mg2+、Mn2+和還原劑巰基乙醇的存在能提高酶活力。譚樹華等[18]研究了脆壁克魯維酵母菌乳糖酶的性質(zhì)，該酶最適作用pH值為6.5～7.0，最適作用溫度為37℃，該酶在pH 值5.8～7.3范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，Mn2+、Mg2+、Na+、K+及微量Ca2+對酶有激活作用。馬克斯克魯維酵母乳糖酶的最適作用溫度、pH值分別為37℃、6.8[19]。金屬離子能在酶蛋白中形成鹽橋，穩(wěn)定酶蛋白的立體結(jié)構(gòu)；巰基乙醇可以防止酶的活性中心受到破壞而提高了酶活性。

3.3 霉菌產(chǎn)生的乳糖酶

霉菌來源的乳糖酶是胞外酶，提取方便，在pH值為2.5～5.4和溫度為50℃左右時，相對活力最高，主要用來處理生產(chǎn)干酪后的酸性乳清。CONNELL S等[21]研究表明，黑曲霉的最適溫度為65℃，最適pH為2.5，分子量為129ku，該乳糖酶在pH值為2.0的條件下，作用2h之后，可保留68%的活力。從土壤中選育到的米曲霉ATCC20423乳糖酶在pH值為3.5～8.0的范圍內(nèi)酶活力穩(wěn)定，溫度為50℃，pH值為5.0時，相對活力最高，酶的相對分子質(zhì)量是90ku，以O(shè)NPG為底物，Km為0.77mmol/L，0.01～0.1mmoL/L氯汞基苯甲酸鹽和碘乙酰胺對酶活力有抑制作用，表明該酶不以巰基為活性中心[20]。炭黑曲霉菌能產(chǎn)生2種乳糖酶，β-gal 1 和β-gal 2，其最適作用溫度分別為55℃、65℃。在胃環(huán)境中這2種酶均有良好的穩(wěn)定性，尤其是β-gal 1，在胃蛋白酶參與和pH值為2.0的條件下，作用2h之后，仍保留70%的活力[24]。

霉菌來源的乳糖酶基因及氨基酸序列之間的同源性較高。亮白曲霉乳糖酶基因組DNA序列含3458bp，其中含有8個內(nèi)含子，cDNA編碼區(qū)長3015bp，共編碼1005個氨基酸，亮白曲霉與同一屬的黑曲霉的同源性為60%左右。其與商業(yè)化應(yīng)用的米曲霉ATCC20423的乳糖酶氨基酸同源性達到99.5%，二者的氨基酸序列僅有3個氨基酸不同[25]。

4 產(chǎn)乳糖酶菌株的選育

4.1 高活力菌株的選育

目前，乳糖酶在乳品、醫(yī)藥、分析、環(huán)境保護等方面都具有廣闊的應(yīng)用前景，然而較低的產(chǎn)量限制了乳糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用。因此，通過遺傳改良選育高活力菌株，是實現(xiàn)乳糖酶高效生產(chǎn)的關(guān)鍵。國內(nèi)外的研究目前主要集中在誘變育種、基因重組上。

常規(guī)的誘變技術(shù)分為物理誘變和化學(xué)誘變兩大類。杜海英等[27]采用紫外線誘變和Co-60γ射線協(xié)同誘變的方法，通過4min的紫外線照射和劑量為500Gy的γ射線對黑曲霉Uco-3的原生質(zhì)體進行誘變，獲得一株產(chǎn)高溫乳糖酶的高產(chǎn)突變株，突變株產(chǎn)酶活力達44.37U/mL，是出發(fā)菌株Uco-3的2.73倍。李寧[28]以產(chǎn)高溫乳糖酶的黑曲霉菌株D2-26作為出發(fā)菌株，經(jīng)1次紫外線和3次Co-60γ射線誘變后獲得1株產(chǎn)高溫乳糖酶的黑曲霉突變株，該突變株產(chǎn)生的高溫乳糖酶活力達16.27U/mL。宋禮[29]用0.1mol/L的亞硝酸處理亮白曲霉孢子懸液11min，涂布平板，再用15W的紫外燈，15cm垂直照射培養(yǎng)平板5min。分離獲得的乳糖酶酶活從原來的0.13U/g提高到了1.1U/g。SIDDIQUE MA等[30]對黑曲霉通過γ-射線進行選育，得到突變株的產(chǎn)酶量比出發(fā)菌株提高了2倍，隨機擴增多態(tài)性（RAPD）表明突變株和出發(fā)菌株的基因相似性為94.83%，突變株和出發(fā)菌株的發(fā)酵初始pH值和溫度分別為5.5和30℃時，產(chǎn)酶能力都最高且突變株的產(chǎn)酶能力高于出發(fā)菌株。

采用基因工程技術(shù)可以克隆不同物種的乳糖酶基因，并且在易于培養(yǎng)、生長繁殖迅速的微生物體內(nèi)表達，從而實現(xiàn)大規(guī)模、低成本生產(chǎn)乳糖酶。燕艷[31]從新疆火焰山篩選出來的菌株Huob菌株，克隆了Huob的乳糖酶基因，然后將此基因轉(zhuǎn)化到原核表達載體PET-30（a）中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒，實現(xiàn)了β-半乳糖苷酶基因在大腸桿菌中的表達，表達量為7.64U/mL，相對原始菌株乳糖酶的表達量提高了18倍。CHEN W等[32]將來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌的耐熱乳糖酶基因（bgaB）轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌WB600中，獲得成功表達，乳糖酶活力提高了45倍。KHALED M等[33]研究表明，0.5%的乳糖和半乳糖能誘導(dǎo)產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）乳糖酶的產(chǎn)生，而0.5%葡萄糖等其他糖對產(chǎn)酶起抑制作用，他將菌血紅蛋白基因（VHb）導(dǎo)入該菌后，能克服0.5%葡萄糖等其他糖的對產(chǎn)酶的抑制作用，并且能提高誘導(dǎo)乳糖酶的生成。DOMINGUES L等[34]構(gòu)建載體將黑曲霉乳糖酶基因lacZ轉(zhuǎn)化到釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）表達系統(tǒng)中，乳糖酶活力達到350U/mL，比原始菌株的酶活提高20倍。

基因工程技術(shù)比誘變育種更能有效的提高乳糖酶的產(chǎn)量。誘變育種技術(shù)操作簡便，科研實踐中采用較為廣泛?；蚬こ碳夹g(shù)很可能從根本上解決乳糖酶產(chǎn)量的問題，但基因工程技術(shù)潛在的危害也不能被忽視。

4.2 微生物產(chǎn)生乳糖酶的獲取方法

4.2.1 傳統(tǒng)方法獲取乳糖酶

用于細(xì)胞內(nèi)乳糖釋放手段主要分為化學(xué)方法和物理方法?；瘜W(xué)方法是利用有機溶劑與細(xì)胞膜中的磷脂與脂蛋白相互作用，使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，增加膜的通透性而釋放乳糖酶。有機溶劑使用較多的是甲苯、乙酸乙酯、和對羥基苯甲酸、SDS-氯仿、甲苯-丙酮等。物理方法是使用物理剪切作用、撞擊作用、空穴作用來破壞細(xì)胞壁，使乳糖酶徹底釋放出來，常用的方法是超聲波破碎法、高壓均質(zhì)法、球磨法。物理和化學(xué)的各種提取酶的方法，需要經(jīng)過比較來選用。

4.2.2 基因工程技術(shù)獲取乳糖酶

長期以來胞內(nèi)乳糖酶提取困難、生產(chǎn)成本高一直是制約乳糖酶生產(chǎn)發(fā)展的重要因素。繼而人們采用基因重組方法將乳糖酶自行分泌到胞外。張偉等[35]通過基因重組技術(shù)將亮白曲霉乳糖酶基因lacb′整合到畢赤酵母染色體上，實現(xiàn)了乳糖酶胞外高效分泌表達，重組酵母乳糖酶的活力為3600U/mL。BECERRA M等[36]以熱敏型酵母突變體釀酒酵母為表達載體，異源表達乳酸克魯維酵母乳糖酶基因，重組體的乳糖酶活性為75U/mL。

5 展望

隨著人們對乳糖酶的進一步研究，乳糖酶的應(yīng)用范圍越來越廣，微生物來源的乳糖酶備受人們關(guān)注。不同來源的乳糖酶的特性不同，其應(yīng)用范圍也存在差異，獲得更多的產(chǎn)乳糖酶的微生物資源可以提高酶的適應(yīng)性。篩選乳糖酶高產(chǎn)菌株，以降低乳糖酶生產(chǎn)應(yīng)用成本。篩選高產(chǎn)、耐熱乳糖酶生產(chǎn)菌株，可避免使用常溫乳糖酶對牛奶體系造成的雜菌污染、水解速率慢、酶的熱穩(wěn)定性差、酶需要量大的問題。開發(fā)低溫乳糖酶微生物資源，可以適應(yīng)低溫條件下乳中乳糖的水解。為了使我國乳品工業(yè)蓬勃發(fā)展，開發(fā)高質(zhì)量的乳糖酶及對乳糖酶生物學(xué)特性的研究，探索其規(guī)律特性，實現(xiàn)乳糖酶工業(yè)化低成本生產(chǎn)已成為刻不容緩的事。

[1]PARK AR,OH DK.Galacto-oligosaccharide production using microbial β-galactosidase:Current state and perspectives[J].Appl Microbiol Biotechnol,2010,85(5):1279-1286.

[2]GOODA E,BEDNARSSKI W,POZNANSKI S.The protein degradation in cheddar cheese manufactured from milk treated with lactase[J].Mil Chwissenschaft,1983,38(2):83-86.

[3]TUGE G,MUSTAFA KS,ERHAN D.Glucose oxidase,β-galactosidase hybrid biosensor based on glassy carbon electrode modified with mercury for lactose determination[J].Anal Chim Acta,2005,551(1-2):51-56.

[4]BANSAL S,OBEROI HS,DHILLON GS,et al.Production of β-galactosidase byKluyveromyces marxianusMTCC 1388 using whey and effect of four different methods of enzyme extraction on β-galactosidase activity[J].Indian J Microbiol,2008,48(3):337-341.

[5]闞 娟，金昌海，汪志君，等.β-半乳糖苷酶及多聚半乳糖醛酸酶對桃果實成熟軟化的影響[J].揚州大學(xué)學(xué)報：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2006，27（3）：76-80.

[6]WEN F,CELOY I,PRICE J,et al.Identification and characterization of a rhizosphere β-glactosidase frompisum sativumL[J].Plant Soil,2008,304(1-2):133-134.

[7]趙 珊.高溫乳糖酶高產(chǎn)菌株發(fā)酵條件優(yōu)化及酶制劑的研究[D].河北：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2008.

[8]QAYYUM H.β-Galactosidases and their potential applications:a review[J].Crit Rev Biotechnol,2010,30(1):41-62.

[9]閻金勇.微生物酶分離純化研究進展[J].現(xiàn)代化工，2007，27（6）：19-23.

[10]NAKAGAWA T,FUJIMOTO Y,RYOKO I,etal.Purification and molecular characterization of cold-active β-galactosidase fromArthrobacter psychrolactophilusstrain F2[J].Appl Microbiol Biotechnol,2006,72(4):720-725.

[11]高兆建，侯進慧，孫會剛，等.耐高溫β-半乳糖苷酶的分離純化與酶學(xué)性質(zhì)分析[J].食品科學(xué)，2010，23（31）：151-156.

[12]SHANE O,WALSH G.A novel acid-stable,acid-active β-galactosidase potentially suited to the alleviation of lactose intolerance[J].Appl Microbiol Biotechnol,2010,86(2):517-524.

[13]劉建福，陳慶森，王 璋.K.fragilisLFS-8611 β-D-半乳糖苷酶的分離純化[J].食品科學(xué)，2005，26（7）：46-49.

[14]沈為群，郭杰炎，李永福.乳酸克魯維酵母β-半乳糖苷酶的分離純化及性質(zhì)研究[J].生物工程學(xué)報，1993，9（4）：348-354.

[15]GARY R,EDWARD S,CHRISTIAN B.Purification,composition and molecular weight of theβ-galactosidase ofEscherichia coliK12[J].J Biol Chem,1965,240(6):2468-2477.

[16]KIM JW,RAJAGOPAL SN.Isolation and characterization of β-galactosidase fromLactobacillus crispatus[J].Folia Microbiol,2000,45(1):29-34.

[17]錢衛(wèi)東，洪奕梅.一株Kluyveromyces lactis 酵母胞內(nèi)乳糖酶性質(zhì)的研究[J].中國釀造.2012，31（3）：32-34.

[18]譚樹華，高向東，吳梧桐.脆壁克魯維酵母乳糖酶提取物性質(zhì)研究[J].藥物生物技術(shù)，2000，7（3）：153-156.

[19]WALSH G,CONNELL S.Purification and properties of a β-galactosidase with potential application as a digestive supplement[J].Appl Microbiol Biotechnol,2007,141(1):1-13.

[20]MICHAEL J,BAILEY,MATTI LINKO VTT.Production of β-galactosidase byAspergillus oryzaein submerged bioreactor cultivation[J].J Biotechnol,1990,16(1-2):57-66.

[21]CONNELL S,WALSH G.Application relevant studies of fungal βgalactosidases with potential application in the alleviation of lactose intolerance[J].Appl Biochem Biotechnol,2008,149(2):129-138.

[22]張 偉，姚 斌，王 磊，等.來源于Aspergillus candidus 的乳糖酶基因的克隆及序列分析[J].生物工程學(xué)報，2002，18（5）：566-570.

[23]LI YUMEI,WANG HM,LU LL,et al.Purification and characterization of a novel β-galactosidase with transglycosylation activity fromBacillus megaterium2-37-4-1[J].Appl Biochem Biotechnol,2009,158(1):192-199.

[24]LEE J M,CHUNG D K,PARK J H.Cloning and nucleotide sequence of the β-galactosidase gene fromLactococcus lactisssp.lactisATCC7962[J].Biotechnol Lett,1997,19(2):179-183.

[25]QU P,ZHU J,LIU L,et al.Functional identiication of a putative βgalactosidase gene in the special lac gene cluster ofLactobacillus acidophilus[J].Curr Microbiol,2010,60(3):172-178.

[26]ONLADDA J,NGUYEN T,THOMAS M,et al.Cloning,purification,and characterization of β-galactosidase fromBacillus licheniformisDSM 13[J].Appl Microbiol Biotechnol,2010,89(3):645-654.

[27]杜海英，于宏偉，韓 軍，等.原生質(zhì)體誘變選育乳糖酶高產(chǎn)菌株[J].微生物學(xué)通報，2006，33（6）：48-51.

[28]李 寧.乳糖酶高產(chǎn)菌株的選育及其產(chǎn)酶研究[D].河北：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

[29]宋 禮.復(fù)合誘變亮白曲霉篩選高產(chǎn)乳糖酶菌株[D].蘭州：蘭州大學(xué)，2010.

[30]SIDDIQUE MA,NABILA T,AYUB N,et al.Gamma radiation induced mutagenesis inAspergillus nigerto enhance its microbial fermentation activity for industrial enzyme Production[J].Mol Biol Rep,2011,38(2):1367-1374.

[31]燕 艷.乳糖酶產(chǎn)生菌的分離鑒定及其基因克隆的研究[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[32]CHEN Wei,CHEN H,XIA Y,et al.Production,purification,and characterization of a potential thermostable galactosidase for milk lactose hydrolysis fromBacillus stearothermophilus[J].J Dairy Sci,2008,91(5):1751-1758.

[33]KHALED M,KHLEIFAT,MUAYAD M.Effects of carbon source andVitreoscillaHemoglobin(VHb)on the production of β-Galactosidase inEnterobacter aerogenes[J].Curr Microbiol,2006,53(6):277-281.

[34]DOMINGUES L,TEIXEIR JA,PENTTILA M,et al.Construction of a flocculentSaccharomyces cerevisiaestrain secreting high levels ofAspergillus nigerβ-galactosidase[J].Appl Microbiol Biotechnol,2002,58(5):645-650.

[35]張 偉，范云六，姚 斌.亮白曲霉乳糖酶基因在畢赤酵母中的高效分泌表達及酶學(xué)性質(zhì)研究[J].微生物學(xué)報，2005，45（22）：247-252.

[36]BECERRA M,CERDAN ME,GONZALEZ S.HeterologousKluyveromyces lactisbeta-galactosidase production and release bySaccharomyces cerevisiaeosmotic-remedial thermosensitive autolytic mutants[J].Biochim Biophys Acta,1997,1335(3):235-241.