潘康成 陳正禮 崔恒敏 馮 興 盛 琴 趙 爽

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,動物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,雅安 625014）

動物腸道中寄生著種類繁多和數(shù)量巨大的微生物,正常情況下,它們之間以穩(wěn)定的比例關(guān)系與宿主腸道相互依存又相互影響,形成動態(tài)的微生態(tài)平衡。腸道正常菌群與腸道免疫系統(tǒng)的形成和功能、腸上皮細(xì)胞的生長有密切關(guān)系,并可以阻擋病原微生物的入侵[1-3]。過去對腸道菌群結(jié)構(gòu)的認(rèn)識常采用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)技術(shù),但由于腸道中約占總數(shù)90%的微生物不能在體外培養(yǎng)[4],因此不能客觀評價(jià)腸道中微生物群落的變化規(guī)律。腸道細(xì)菌基因間保守重復(fù)序列（ERIC）-聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是近年來被廣泛用于菌群結(jié)構(gòu)及種群變化的一種分子生物學(xué)方法,該方法快速、簡潔、不依賴于純培養(yǎng),可直接根據(jù)樣品ERIC條帶的分布、數(shù)量和亮度等信息去分析,靈敏度、可重復(fù)性和可靠性較好[5-6]?；?6S rDNA為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展,不依賴微生物培養(yǎng)的分子生物技術(shù)為研究腸道微生態(tài)提供了簡便而快捷的方法[7],其中變性梯度凝膠電泳（DGGE）技術(shù)近年來逐漸被應(yīng)用于檢測豬、牛、羊和雞等腸道主要細(xì)菌類群的多態(tài)性[8-12]。目前,關(guān)于用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法檢測枯草芽孢桿菌對肉雞消化道菌群的影響已有報(bào)道。閆鳳蘭等[13]報(bào)道肉仔雞飼喂枯草芽孢桿菌D1制劑后可顯著增加腸道中乳桿菌的數(shù)量和極顯著減少沙門氏菌的數(shù)量,但對大腸桿菌沒有影響。Teo等[14]報(bào)道肉雞飼喂每t含有109個枯草芽孢桿菌的飼糧,對腸道乳桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量沒有影響,但可使有害菌如大腸桿菌和梭菌的數(shù)量減少1～2 lg（CFU/g）。但利用ERIC-PCR和PCR-DGGE分析動物飼喂芽孢桿菌之后腸道菌群結(jié)構(gòu)及多樣性未見報(bào)道,因此本試驗(yàn)擬通過對肉雞喂服枯草芽孢桿菌Pab02菌懸液后,采用ERIC-PCR和PCR-DGGE方法研究腸道菌群結(jié)構(gòu)的多樣性,為該菌的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 芽孢桿菌菌懸液的制備

枯草芽孢桿菌Pab02菌種（本實(shí)驗(yàn)室保存）經(jīng)活化后,接種于2 000m L營養(yǎng)肉湯中,37℃、160 r/m in振蕩培養(yǎng)18 h。5 000 r/m in、4℃離心20m in,收集菌體,無菌PBS（0.05m ol/L、pH 6.5）調(diào)整活菌濃度至1×109CFU/m L,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 動物分組及飼養(yǎng)

1日齡的艾維茵肉雞30只常規(guī)飼養(yǎng)至28日齡,體重（1 050.5±56.1）g,隨機(jī)分成2組,即試驗(yàn)組和對照組。試驗(yàn)組按2 m L/kg BW喂服菌懸液,每日08:00和20:00各1次,連續(xù)3 d。對照組喂服等量的滅菌PBS液。2組雞分別飼養(yǎng)于不同雞舍內(nèi),自由采食不含任何抗生素和微生態(tài)制劑的飼料,自由飲水。舍內(nèi)溫度控制在20～25℃。

1.3 腸道菌群總DNA的提取

上述雞只,在停服芽孢桿菌3 d后即34日齡時(shí),每組取5只,頸動脈放血處死,各取十二指腸、空腸、回腸和盲腸內(nèi)容物約1 g,稱重并置于50m L滅菌離心管內(nèi),按照張保衛(wèi)等[15]的方法抽提細(xì)菌基因組,基因組定容于50μL TE緩沖液中溶解,-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 ERIC-PCR和PCR-DGGE分析

1.4.1 ERIC-PCR反應(yīng)

引物ERIC-1:5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′和ERIC-2:5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′。PCR反應(yīng)體系（25μL）:2.5μL 10×Taq Buffer（500mmol/L KCl、100mm ol/L Tris-HCl、15 mmol/L MgCl2）,4μL dNTP mixture（各2.5 mmol/L）,0.5μL Taq酶（5 U/μL）,20 pm ol/L上下游引物各1.5μL,2μL DNA模板,補(bǔ)ddH2O至25μL。反應(yīng)條件:95℃7min,30個循環(huán)（95℃30 s、52℃1m in、65℃8 min）,65℃16min。

1.4.2 16S rRNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增

根據(jù)大腸桿菌16S rRNA基因V 3片段（339～539）設(shè)計(jì)一對引物:HDA 1-GC（5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT-3′）和HDA 2（5′-GTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3′）。PCR反應(yīng)體系（25μL）:2×Long Taq M aster M ix 10μL,引物（10 pm ol/μL）各1μL,模板DNA 1μL,ddH 2O補(bǔ)足25μL。PCR擴(kuò)增條件:94℃4m in,30個循環(huán)（94℃30 s、58℃30 s、72℃2m in）,最后72℃延伸10 m in。

1.4.3 腸道菌群DNA的ERIC-PCR/PCRDGGE圖譜分析

以提取的各腸段細(xì)菌DNA作為模板,按上述反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增,ERIC-PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳并拍照。16S rRNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分離,反應(yīng)條件為:10%聚丙烯酰胺凝膠,變性劑濃度梯度為35%～65% （7 mo l/L尿素和40%去離子甲酰胺為100%變性劑）,電泳采用D-code DGGE系統(tǒng)（Bio-Rad）,電泳緩沖液為1×TAE,200 V預(yù)電泳5m in,85 V電泳16 h,電泳結(jié)束后進(jìn)行硝酸銀染色,并將DGGE條帶用凝膠成像系統(tǒng)拍照。使用分析軟件NTSYS 2.1對ERIC-PCR/PCR-DGGE指紋圖譜進(jìn)行條帶計(jì)數(shù),用D ice方法計(jì)算相似性指數(shù)Cs,用UPGM A （unweighted pair group mean average）進(jìn)行聚類。

1.5 割膠回收條帶并克隆測序

將DGGE圖譜上出現(xiàn)的特征性條帶割膠回收,用無菌去離子水沖洗3次,放入1.5 m L離心管中,加入100μL TE緩沖液4℃過夜,取1μL為模板,按1.4.2方法再次擴(kuò)增16S rDNA V3區(qū),擴(kuò)增產(chǎn)物做DGGE電泳確認(rèn)正確性,重復(fù)1～3次,直至在圖譜上得到單一條帶。然后,取1μL回收的純化DNA為模板,采用不帶GC發(fā)夾的引物（HDA 1:5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT-3′,HDA 2:5′-GTATTACCGCGGCTG CTGGCAC-3′）按1.4.2方法擴(kuò)增V3區(qū)。PCR產(chǎn)物經(jīng)pMD18-T載體連接,轉(zhuǎn)化E.coliDH 5α感受態(tài)細(xì)胞,在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上選擇具有氨芐青霉素抗性的白色轉(zhuǎn)化子,采用T載體通用引物進(jìn)行菌落PCR檢測,送菌液至上海生工生物技術(shù)公司進(jìn)行測序,將序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié) 果

2.1 肉雞腸道菌群ERIC-PCR/PCR-DGGE指紋圖譜及條帶數(shù)

ERIC-PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示,對照組中擴(kuò)增條帶以盲腸數(shù)量最多,其次是空腸和回腸,十二指腸最少;肉雞喂服芽孢桿菌Pab02菌懸液后腸道的條帶數(shù)都有一定程度增加,而且條帶的亮度普遍提高,說明腸道菌群多樣性豐富和種群密度有所增加,條帶數(shù)量以空腸最多,其次是十二指腸,最后是盲腸和回腸。16 S rRNA V 3區(qū)的PCR-DGGE擴(kuò)增結(jié)果,對照組中擴(kuò)增條帶以盲腸數(shù)量最多,其次是空腸和回腸,十二指腸最少;肉雞喂服芽孢桿菌Pab02菌懸液后,各腸段的條帶數(shù)及特征性條帶均明顯多于對照組,說明肉雞口服芽孢桿菌Pab02后腸道菌群多樣性豐富和種群密度有所增加,與ERIC-PCR結(jié)果相似,不同的是PCR-DGGE的條帶數(shù)量比ERICPCR更多,肉雞口服芽孢桿菌Pab02后,腸道中的條帶數(shù)量順序分別為盲腸、空腸、十二指腸、回腸（圖1和表1）。

圖1 肉雞腸道菌群ERIC-PCR（上圖）和PCR-DGGE（下圖）指紋圖譜Fig.1 ERIC-PCR（above）and PCR-DGGE（dow n）fingerprint of intestinalm icroflora of broilers

表1 肉雞腸道菌群ERIC-PCR和PCR-DGGE條帶數(shù)Table 1 The number of ERIC-PCR and PCR-DGGE bands of intestinalm icroflora of broilers（x—±SD）

2.2 ERIC-PCR/PCR-DGGE檢測肉雞腸道菌群多樣性

ERIC-PCR條帶聚類相似性分析結(jié)果,對照組中的十二指腸、空腸、回腸和盲腸的腸道菌群組成相似性分別為87.5%、70.8%、75.0%和72.9%,各腸段總相似性為52.5%;肉雞連續(xù)喂服芽孢桿菌Pab02菌懸液3 d,并停服3 d后,各腸段腸道菌群組成相似性分別為88.9%、69.4%、81.5%和72.2%,各腸段總相似性為62.7%;2組之間腸道菌群的相似性為53.2%。PCR-DGGE條帶聚類相似性分析結(jié)果,對照組中的十二指腸、空腸、回腸和盲腸的腸道菌群組成相似性分別為63.9%、57.2%、71.0%和65.8%,各腸段總相似性為46.9%;肉雞連續(xù)喂服芽孢桿菌Pab02菌懸液3 d,并停服3 d后,各腸道菌群組成相似性分別為66.7%、60.0%、67.2%和82.2%,各腸段總相似性為59.4%。2組之間腸道菌群的相似性為53.2%（圖2）。

圖2 肉雞腸道菌群ERIC-PCR和PCR-DGGE條帶相似性分析Fig.2 Sim ilarity analysis of intestinalm icro flora of broilers by ERIC-PCR and PCR-DGGE

2.3 DGGE圖譜對應(yīng)的腸道優(yōu)勢條帶DNA序列分析

分別選取對照組和試驗(yàn)組的DGGE圖譜上出現(xiàn)的7個共同條帶和8個試驗(yàn)組的特異性條帶,共15條特征性條帶割膠回收,進(jìn)行測序,在NCBI中進(jìn)行BLAST對比,結(jié)果見表2。這些回收測序條帶中,第7號、第11號、第12號和第15號條帶序列為未培養(yǎng)的細(xì)菌（均為試驗(yàn)組條帶）,其余條帶都是已知的基因庫中收錄種屬,而鑒定出來的細(xì)菌以乳桿菌居多,表明乳桿菌在肉雞腸道中屬于優(yōu)勢菌群。

表2 DGGE圖譜對應(yīng)的單個條帶DNA序列Tab le 2 Sequences analysis of DNA recovered from single band in DGGE fingerp rints

3 討 論

3.1 肉雞喂服芽孢桿菌Pab02后對腸道菌群結(jié)構(gòu)多樣性影響

由于腸道正常菌群的功能越來越受到重視,腸道菌群結(jié)構(gòu)多樣性和種群的動態(tài)變化也逐漸成為人們研究的熱點(diǎn)。過去,對腸道菌群結(jié)構(gòu)多樣性和種群變化的認(rèn)識,主要通過傳統(tǒng)的選擇性培養(yǎng)細(xì)菌和分型鑒定。由于動物腸道內(nèi)的菌群種類繁多,數(shù)量巨大,人們對許多細(xì)菌的生存狀況及其生理特性缺乏了解,絕大部分的細(xì)菌種群無法通過純培養(yǎng)的方法獲得,從而導(dǎo)致低估菌群結(jié)構(gòu)的多樣性[4,16]。

ERIC-PCR和PCR-DGGE是近年來被廣泛用于菌群結(jié)構(gòu)及種群變化的分子生物學(xué)方法,與其他方法相比,其靈敏度、可重復(fù)性和可靠性更好,省時(shí)省力,克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力等缺點(diǎn)。本試驗(yàn)對正常對照組肉雞各腸段的菌群DNA進(jìn)行ERIC-PCR檢測,各腸段內(nèi)的菌群DNA擴(kuò)增條帶以盲腸數(shù)量最多,其次是空腸和回腸,十二指腸最少。用PCR-DGGE檢測時(shí)其腸道菌群DNA擴(kuò)增條帶數(shù)量、排序順序與ERIC-PCR方法檢測的結(jié)果相似。與倪學(xué)勤等[17]、Gong等[18]采用PCRDGGE檢測蛋雞的腸道菌群DNA擴(kuò)增結(jié)果相似。肉雞喂服芽孢桿菌Pab02菌懸液3 d,并在停服3 d后分別采集各腸段內(nèi)容物提取基因組,分別進(jìn)行ERIC-PCR和PCR-DGGE分析,結(jié)果2種方法證明肉雞口服枯草芽孢桿菌Pab02后各腸段的條帶數(shù)及特征性條帶均明顯多于對照組,差異顯著,說明枯草芽孢桿菌Pab02具有增加肉雞腸道菌群多樣性和種群密度的功能。與Pieper等[19]報(bào)道仔豬斷奶前3天和斷奶后3天口服植物乳桿菌菌懸液后,采用PCR-DGGE檢測仔豬第25天（斷奶時(shí)）、第28天、第33天和第39天的腸道菌群多樣性的變化一致。

在對電泳條帶的聚類分析中,ERIC-PCR檢測對照組中的十二指腸、空腸、回腸和盲腸的腸道菌群組成相似性分別為87.5%、70.8%、75.0%和72.9%,各腸道總菌群的相似性為52.5%;而肉雞連續(xù)喂服枯草芽孢桿菌Pab02菌懸液3 d后,十二指腸、空腸、回腸和盲腸的腸道菌群組成相似性分別為88.9%、69.4%、81.5%和72.2%,各腸道總菌群的相似性為62.7%。PCR-DGGE檢測對照組中的十二指腸、空腸、回腸和盲腸的腸道菌群組成相似性分別為63.9%、57.2%、71.0%和65.8%,各腸道總菌群的相似性為46.9%;而肉雞連續(xù)喂服枯草芽孢桿菌Pab02菌懸液3 d后,十二指腸、空腸、回腸和盲腸的腸道菌群組成相似性分別為66.7%、60.0%、67.2%和82.2%,各段腸道總菌群的相似性為59.4%。結(jié)果說明2組腸道細(xì)菌之間存在著一定種群的差異性,但2組之間腸道總菌群的相似性ERIC-PCR和PCR-DGGE檢測均為53.2%,仍然存在著比較高的相似性。在正常情況下,雖然腸道內(nèi)細(xì)菌種類和數(shù)量會隨著腸道內(nèi)環(huán)境的改變和年齡的增長等生理因素而有所改變,但在一定的年齡階段,腸道正常菌群是機(jī)體內(nèi)一種相對穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng),與宿主相互依賴又相互作用,保持著動態(tài)的微生態(tài)平衡[1-2]。進(jìn)一步對DGGE分離的7條對照組和試驗(yàn)組的共性條帶,以及8條試驗(yàn)組的特異性條帶進(jìn)行克隆測序,結(jié)果表明,在34日齡的肉雞腸道中主要以乳桿菌為主要菌群,飼喂芽孢桿菌Pab02后能提高肉雞腸道乳桿菌種群的豐度和密度。

3.2 ERIC-PCR和PCR-DGGE檢測肉雞腸道菌群結(jié)構(gòu)的比較

在復(fù)雜的樣品如腸道內(nèi)容物或糞便,電泳分析ERIC-PCR和PCR-DGGE擴(kuò)增得到的不同生態(tài)系統(tǒng)微生物群落指紋圖譜,不同系統(tǒng)中有很多條帶具有相同的電泳特性,但其序列組成信息不同。對于ERIC-PCR,每個種或菌株因染色體上帶有的ERIC重復(fù)序列個數(shù)和片段大小不同,加上瓊脂糖凝膠電泳的分辨率小,可能導(dǎo)致指紋圖譜上多種細(xì)菌的特異性條帶在同一位置上相互疊加。基于細(xì)菌16S rRNA/rDNA基因序列中可變區(qū)（V3區(qū)或V6～V8區(qū)）配對的引物,擴(kuò)增出細(xì)菌16S rRNA/rDNA基因的部分序列,并通過DGGE得到分離,電泳條帶的數(shù)目、位置和強(qiáng)度可反映樣品中微生物的種類及細(xì)菌的相對構(gòu)成比例,反映樣本的微生物結(jié)構(gòu)多樣性,它的分辨精度高,可以檢測到1個核苷酸水平的差異,因此該技術(shù)在揭示自然界微生物區(qū)系的遺傳多樣性和種群差異方面具有獨(dú)特的優(yōu)越性。Y ang等[20]通過ERIC-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后,采用瓊脂糖凝膠電泳（AGE）和DGGE對比分析鵝腸道菌群結(jié)構(gòu)多樣性,研究結(jié)果表明,腸道菌群DNA電泳條帶數(shù)量差異性與采用的PCR技術(shù)關(guān)聯(lián)小,而與電泳的凝膠類型有關(guān),因此凝膠電泳的選擇比PCR過程更重要。通過本試驗(yàn)2種檢測方法均可證明肉雞口服枯草芽孢桿菌Pab02后可以提高腸道菌群的豐度和種群密度,對照組和試驗(yàn)組各腸段總菌群的相似性均為53.2%,但從電泳指紋圖譜和統(tǒng)計(jì)條帶數(shù)量分析PCR-DGGE明顯優(yōu)于ERIC-PCR。

4 結(jié) 論

①采用ERIC-PCR和PCR-DGGE對比檢測肉雞口服芽孢桿菌Pab02后腸道菌群結(jié)構(gòu)的多樣性,2種檢測方法結(jié)果相同,肉雞口服枯草芽孢桿菌Pab02后可以提高腸道菌群的豐度和種群密度,對照組和試驗(yàn)組各腸段總菌群的相似性均為53.2%。

②從電泳指紋圖譜和統(tǒng)計(jì)條帶數(shù)量分析PCRDGGE明顯優(yōu)于ERIC-PCR。

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*Correspond ing au thor,p rofessor,E-m ail:cuihengm in2008@sina.com

（編輯 何麗霞）