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(1.溫州市第三人民醫(yī)院，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)學(xué)院 仁濟學(xué)院，浙江 溫州 325035)

《中國藥典》[1]記載，車前子為車前科植物車前PlantagoasiaticaL.或平車前PlantagodepressaWilld.的干燥成熟種子， 具有清熱利尿、滲濕通淋、明目、祛痰的功能，用于治療水腫脹滿、熱淋澀痛、暑濕泄瀉、目赤腫痛、痰熱咳嗽。在臨床上可治各種病癥[2]。目前，國內(nèi)外對車前子多糖的研究表明,車前子多糖具有抗炎、緩泄、抗衰老、抗氧化、清除自由基、保護動脈內(nèi)皮、整腸通便、降低血脂、調(diào)節(jié)血糖的作用[3-11]。車前子多糖的主要組成單糖是木糖和阿拉伯糖等戊糖[12],殷軍藝等[13]對大粒車前子多糖分離、純化及單糖組成分析的研究中，經(jīng)GC-MS分析確定PLP由阿拉伯糖、木糖、甘露糖和半乳糖構(gòu)成，其摩爾比為5.6∶9.4∶1.3∶1，但文獻報道中車前子多糖測定通常都是以己糖(如葡萄糖)作為標準對照品。所以本實驗采用周超等[14]在研究中建立的一種準確測定車前子多糖的方法，即采用苯酚-硫酸法測定車前子中多糖量，以木糖作為標準對照物，檢測波長480 nm，希望更準確地測定車前子中多糖的含量。為在選用車前子的不同炮制品時，提供量的參考。

1 實驗部分

1.1 實驗材料 751-GW分光光度計(惠普上海分析儀器有限公司),80-2離心機(上海手術(shù)器械廠)，隔膜真空泵(天津市津藤實驗設(shè)備有限公司)，單相電容運轉(zhuǎn)電動機(上海申生科技有限公司)，美的多功能電磁爐(廣東美的生活電器制造有限公司)，萬用電熱器(浙江嘉興市風橋電熱器廠制造)，分析天平，冰箱，透析袋，回流裝置，容量瓶(25、100 mL)，移液管(0.5、1、5 mL)，離心管，燒杯，玻璃棒；D-木糖，80%，95%乙醇，無水乙醇，丙酮，乙醚，氯仿-正丁醇(4∶1)，3%苯酚，濃硫酸，蒸餾水，自來水；車前子，自然曬干。

1.2 實驗方法

1.2.1 車前子的炮制 歷史沿革：宋代有酒浸(《總錄》)、微炒(《局方》)、焙(《寶產(chǎn)》)、酒蒸(《濟生方》)等炮制方法。明代還有米泔水浸蒸(《醒齋》)的方法。清代又增加了青鹽水(《幼幼集成》)。并有“酒蒸搗碎，入滋補藥；炒研，入利水泄瀉藥”(《備要》)的記載?，F(xiàn)在主要的炮制方法有炒黃、鹽炙等。生品車前子：取車前子，除雜質(zhì)，篩去灰屑。清炒車前子：取凈車前子，置炒制容器內(nèi)，用文火加熱，炒至略有爆聲，并有香氣逸出時，取出晾涼。鹽炙車前子：取凈車前子，置炒制容器內(nèi)，用文火加熱，炒至略有爆鳴聲時，噴淋鹽水，炒干，取出晾涼。

1.2.2 車前子多糖的提取與精制 稱取干燥的生品車前子50 g,加8倍量體積分數(shù)80%乙醇浸泡24 h，過濾，揮干乙醇，加水于沸水浴中回流提取3 h,紗布兩層過濾，濾渣再回流提取2 h，合并濾液，濃縮，加95%乙醇至醇濃度達到80%，冰箱中冷藏過夜。次日離心分離(4 000 r/min，10 min)，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌兩次，干燥得生品車前子粗多糖，稱量。做2分，其中1分精制，備用。生品車前子粗多糖用蒸餾水溶解，Seva ge法除蛋白[15]，然后用流動自來水透析48 h，蒸餾水透析24 h，透析液濃縮,加95%乙醇至醇濃度達到80%，冰箱中冷藏過夜。次日離心分離(4 000 r/min，10 min)，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌2次，干燥得生品車前子精多糖，稱量。

1.2.3 標準曲線的繪制 準確稱取干燥至恒量的D-木糖標準品25.10 mg,置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水配成0.251 0 mg/mL的溶液。準確移取此溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mL，分別置于25 mL容量瓶中，稀釋至刻度，配成系列標準溶液，濃度為0.005，0.010，0.015，0.020，0.025，0.030，0.035 mg/mL。最佳顯色條件：在上述配制的系列溶液中分別取2.0 mL，加3%苯酚0.5 mL，搖勻后加濃硫酸4.0 mL,充分混合均勻，25℃室溫放置35 min，在480 nm處測量吸光度。

1.2.4 換算因子的測定 精密稱取生品車前子的精制多糖0.030 0 g，配制成0.03 mg/mL，按照1.2.3確定的最佳顯色條件,由回歸方程求出生品車前子精制多糖液中木糖的濃度。按下式計算換算因子f=m/(C·D)。式中:m-稱取精制多糖的質(zhì)量(mg)，C-精制車前子多糖中木糖的質(zhì)量濃度(mg/mL)，D-多糖的稀釋因素(mL)。

1.2.5 樣品中車前子多糖的測定 精密稱取生品車前子粗多糖0.030 0 g，配制成0.03 mg/mL,按照1.2.3確定的最佳顯色條件，由回歸方程求出生品車前子精制多糖液中木糖的濃度。按下式計算樣品中多糖的量:W/%=C·D·f/m×100。式中:C-供試液中木糖的濃度(mg/mL)，D-多糖的稀釋因素，f-換算因子，m-供試車前子多糖的質(zhì)量(mg)。清炒和鹽炙的車前子粗多糖都作同等條件的處理，分別得出相應(yīng)的多糖含量。

2 結(jié)果

2.1 標準曲線 在確定的最佳顯色條件下測定吸光度，以吸光度(A)對木糖濃度(C)作回歸處理，得回歸方程：C=0.030 3 A-0.000 7，R=0.999 6。木糖標準品在0～0.035 mg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.2 換算因子 經(jīng)過對精制車前子多糖吸光度的測定，并計算后，求得車前子多糖相對于D-木糖的換算因子：f=1.571。

2.3 多糖含量 經(jīng)過對粗品車前子不同炮制品的吸光度測定，由回歸方程求出相應(yīng)的車前子精制多糖液中木糖的濃度，并通過計算，得出結(jié)果。如表1。

表1 車前子不同炮制品多糖含量測定結(jié)果

2.4 精密度試驗 準確移取0.03 mg/mL粗多糖樣品溶液2 mL，按照1.2.3確定的最佳顯色條件，平行測定5份。相對標準偏差RSD=0.98%。

2.5 穩(wěn)定性試驗 準確移取0.03 mg/mL粗多糖樣品溶液2 mL，按照1.2.3確定的最佳顯色條件，間隔15 min讀取顯色后的樣品溶液吸光度，連續(xù)1 h考察其穩(wěn)定性。相對標準偏差RSD=0.44%。

2.6 加標回收率 準確移取0.03 mg/mL粗多糖樣品溶液2 mL,加入不同濃度的木糖標準溶液各1 mL，按照1.2.3確定的最佳顯色條件，計算回收率(平行測定2次)。結(jié)果見表2。

表2 加標回收率測定結(jié)果

3 討論

本次實驗測定車前子多糖含量采用苯酚-硫酸法，檢測波長為480 nm，由于車前子多糖的主要組成單糖是木糖和阿拉伯糖等戊糖[12],所以本實驗以D-木糖作為標準對照品，這與以往文獻報道中車前子多糖測定通常都是以己糖(如葡萄糖)作為標準對照品所不同,利用D-木糖與精制多糖的換算因子計算多糖量，得出的結(jié)果更能準確地反映其真實值。

通過對車前子不同炮制品多糖含量的測定，不難發(fā)現(xiàn)炮制后的車前子多糖含量較生品均降低，王東等[16]對車前子及其炮制品中多糖含量的分析研究結(jié)果中表明,3種車前子炮制品，無論是清炒還是鹽炙，其多糖含量較生品都有所降低，與本實驗結(jié)果相符。

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