金玉玲,陸曉紅,綦 瑩,羅海龍,吳盛華,陸春風(fēng)

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003;2.哈爾濱市兒童醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150000;3.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院,黑龍江 牡丹江 157006;4.佳木斯市中心醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154002)

NSCs攜帶外源基因治療為神經(jīng)系統(tǒng)疾病變的治療及機(jī)制探討提供了廣闊的前景[1],為揭示神經(jīng)系統(tǒng)中各種轉(zhuǎn)錄因子作用相關(guān)機(jī)制等問題提供了良好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。擴(kuò)增 AdHIF-1α--GFP后轉(zhuǎn)染 NSCs,免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測轉(zhuǎn)染后 N SCs基因表達(dá)情況、V EGF和 NF-κ B的表達(dá)情況及給予梯濃度 N F-κ B特異性抑制劑 PDTC后 AdHIF-1α--GFP修飾后 NSCs中 VEGF的表達(dá)情況。從而進(jìn)一步認(rèn)識HIF-1α在 CI后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 ,為深入了解 NF-κB在發(fā)揮腦保護(hù)效用中的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑

DMEM/F12、B27(為 Gibico產(chǎn)品),人基因重組表皮生長因子(EGF)、人堿性纖維生長因子(bFGF)(為 Invitrogen產(chǎn)品 ),兔抗 Nestin多克隆抗體、羊抗兔 IgG-CY3、兔抗HIF-1 α多克隆抗體、兔抗 NF-κB多克隆抗體、兔抗 V EGF多克隆抗體(北京博澳森),SABC(大鼠)試劑盒,HIF-1α質(zhì)粒在 Ad載體中并帶有 GFP標(biāo)記 ,空載體 Ad帶有 GFP標(biāo)記(由重慶醫(yī)科大學(xué)胡長林教授饋贈),HEK293-細(xì)胞33代次(北京本元正陽)。

1.2 方法

1.2.1 進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)

取新生 24h內(nèi)的 Wistar大鼠,無菌取出海馬,Hanks液漂洗剪碎后吹打,用 200目篩網(wǎng)過濾后1000r/min離心5min,棄上清,加入完全 N SCs培養(yǎng)液1mL,吹打成細(xì)胞懸液,接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,放置37℃,5%的 CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),每隔2d換液。7d后傳代,傳3代后備用。參考蔡文琴等[2]方法,采用免疫細(xì)胞化學(xué)法和熒光法進(jìn)行 nestin染色鑒定是否為N SCs[3]。

1.2.2 AdHIF-1α--GFP及空 Ad--GFP的擴(kuò)增

取細(xì)胞密度 70%左右 33代 HEK293細(xì)胞,PBS5mL沖洗1次;取 1mL AdHIF-1 α--GFP平鋪加入培養(yǎng)瓶,并左右微斜,使其均勻平鋪瓶底,放入細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育2h后加入2%細(xì)胞維持液2mL孵育24h后,90%以上細(xì)胞變圓且漂浮,在熒光顯微鏡下觀察,475nm波長藍(lán)光激發(fā)光下觀察508nm的綠色熒光。并在熒光顯微鏡下成像,將細(xì)胞懸液三凍三融后5000r/5min離心,0.22濾器抽濾后分裝 EP管于-80℃冰箱凍存。采用細(xì)胞計數(shù)及 MTT方法用 Reed-Muench法計算病毒滴度及感染復(fù)數(shù)。

1.2.3 檢測基因轉(zhuǎn)染后 NSCs中 HIF-1 α表達(dá)

熒光檢測 N SCs中 AdHIF-1 α--GFP及空載體 Ad-GFP表達(dá),分別提取基因轉(zhuǎn)染后 N SCs、空載體轉(zhuǎn)染 NSCs、正常 N SCs蛋白做免疫細(xì)胞化學(xué)染色法[4]檢測 HIF-1 α表達(dá)。

1.2.4 檢測各組 NSCs中 N F-κB和 V EGF表達(dá)

分別提取基因轉(zhuǎn)染后 N SCs、空載體轉(zhuǎn)染 NSCs、正常NSCs蛋白做免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測 NF-κ B和 V EGF表達(dá)。

1.2.5 檢測給予 NF-κ B梯濃度抑制劑后基因轉(zhuǎn)染 N SCs中 V EGF表達(dá)

HIF-1α基因修飾的 NSCs中按 50μ mol/L、 150μmol/L、300 μmol/L濃度梯度加入特異性抑制劑二硫氨基甲酸酞吡咯烷(PDTC)[5],免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測其中 V EGF的表達(dá)變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (±s)表示 ,采用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析及t檢驗(yàn)統(tǒng)計學(xué)處理。P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測基因轉(zhuǎn)染后神經(jīng)干細(xì)胞中 HIF-1α表達(dá)

免疫細(xì)胞化學(xué)顯示,HIF-1 α染色可見幾乎所有細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒,胞核呈藍(lán)色,構(gòu)成的細(xì)胞集落形狀較規(guī)則,呈橄欖球形或球形,但未處理神經(jīng)干細(xì)胞組及空載體神經(jīng)干細(xì)胞組細(xì)胞中無HIF-1α染色陽性表達(dá)。

2.2 檢測各組神經(jīng)干細(xì)胞中 NF-κB表達(dá)結(jié)果

見表 1。

表 1 AdHIF-1α--GFP轉(zhuǎn)染后 NSCs中 N F-κ B表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)比較 (±s,n=6)

表 1 AdHIF-1α--GFP轉(zhuǎn)染后 NSCs中 N F-κ B表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)比較 (±s,n=6)

*:與空載體組和正常組相比,P ＜0.05。

1次 2次 3次正常 NSCs 2.31± 0.20 3.65± 0.68 8.30±1.31空載體組 2.57± 0.12 3.52± 0.53 2.57±1.55基因轉(zhuǎn)染組 8.16± 1.62* 8.75± 0.96* 8.30± 1.21*F 73.37 96.09 94.36

2.3 各組神經(jīng)干細(xì)胞中 VEGF表達(dá)結(jié)果

見表2。

表2 AdHIF-1α--GFP轉(zhuǎn)染后 NSCs中 VEGF表達(dá)比較 (±s,n=6)

表2 AdHIF-1α--GFP轉(zhuǎn)染后 NSCs中 VEGF表達(dá)比較 (±s,n=6)

*:與空載體轉(zhuǎn)染組及正常神經(jīng)干細(xì)胞組相比較,P＜0.05。

1次 2次 3次正常 NSCs 1.83± 0.13 1.26± 0.34 1.10±0.30空載體組 1.70± 0.25 1.54± 0.36 1.36±0.37基因轉(zhuǎn)染組 9.40± 2.28* 10.57± 3.96* 10.26± 3.15*F 66.49 31.6 48.12

2.4 加入 N F-κB特異性抑制劑后 HIF-1α基因修飾的神經(jīng)干細(xì)胞 V EGF的表達(dá)

見表3。

表3 轉(zhuǎn)染后 N SCs給予梯濃度抑制劑 PDTC后V EGF陽性細(xì)胞數(shù)比較 (±s)

表3 轉(zhuǎn)染后 N SCs給予梯濃度抑制劑 PDTC后V EGF陽性細(xì)胞數(shù)比較 (±s)

1次 2次 3次50 μ mol/L 19.78± 2.46 20.60± 1.65 19.42± 1.83 150μ mol/L 13.93± 1.97 14.12± 2.50 11.80± 1.52 300 μ mol/L 4.67± 0.84 7.25± 2.50 6.84± 1.48 F 97.64 74.66 91.88

300μ mol/L組與 150μ mol/L組相比 ,P＜ 0.05,有顯著差異;50 μ mol/L組 與 150 μ mol/L 組相 比,P＜ 0.05;300 μ mol/L組 與50 μ mol/L組相比P＜ 0.05。

3 討論

HIF-1α是在缺血缺氧條件下發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄因子,一系列與組織耐受缺血缺氧環(huán)境有關(guān)的基因都由它激活轉(zhuǎn)錄[6]。我們用免疫細(xì)胞化學(xué)染色的方法顯示轉(zhuǎn)染 AdHIF-1α-GFP組有 HIF-1α陽性細(xì)胞的表達(dá),而 Ad-GFP組和正常 NSCs組無 HIF-1 α陽性細(xì)胞的表達(dá),在同樣的反應(yīng)條件下,AdHIF-1α-GFP組 HIF-1α陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于Ad-GFP組和正常 NSCs組。提示重組的 AdHIF-1α-GFP以轉(zhuǎn)入神經(jīng)干細(xì)胞并有 HIF-1α的表達(dá)。為下一步探討目的基因 HIF-1 α的作用信號轉(zhuǎn)錄機(jī)制做了良好的鋪墊。

很多研究發(fā)現(xiàn),在腦缺氧損傷區(qū)域 N F-κ B與 V EGF表達(dá)呈正相關(guān)[7]。因此,我們大膽假設(shè),NF-κ B是否處于 HIF-1α上調(diào) V EGF作用通路上并起重要作用。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計為以 HIF-1α修飾的 NSCs為載體,給予抑制 NF-κ B生物活性后檢測 V EGF的表達(dá),為排除不確定的影響因素,使用國內(nèi)外公認(rèn)的 N F-κ B特異性抑制劑 PDTC(吡咯烷二硫代氨基甲酸酯,pyrrolidindithiocarbamate)[8],以實(shí)現(xiàn)特異性抑制N F-κB表達(dá)的目的。PDTC是一種抗氧化劑,能有效抑制N F-κB活性及表達(dá)。作用原理主要通過兩方面:一是抑制N F-κ B的 p65亞單位,一是通過其金屬螯合作用。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示 HIF-1α修飾的 NSCs給予梯濃度 PDTC后,VEGF陽性細(xì)胞數(shù)呈梯濃度依賴性下調(diào),各濃度組陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)間有統(tǒng)計學(xué)差異 (P＜0.05)。符合我們最初的猜想。

本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng) HIF-1α基因修飾的 N SCs,采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)方法研究 HIF-1α修飾 N SCs后各種轉(zhuǎn)錄因子表達(dá) ,有助于我們認(rèn)識 HIF-1α在 CI后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,對 CI的治療有著積極而重要的指導(dǎo)意義。

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