劉春秀

(濟(jì)寧市醫(yī)院耳鼻喉科,山東 濟(jì)寧 272100)

喉癌(laryngocarcinoma)是頭頸部常見惡性腫瘤之一,其致病原因迄今尚不完全明了,環(huán)氧化酶(cyclooxygenase,COX)是分解花生四烯酸(AA)、生成各種內(nèi)源性前列腺素(prostaglandin,PG)過程中重要的限速酶 ,催化產(chǎn)生的 PG參與機(jī)體多種生理及病理過程。近年來,國(guó)內(nèi)外諸多研究表明,COX-2除了在炎癥中發(fā)揮重要作用外,還與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)[1]。惡性腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移依賴于新生血管的形成,COX-2與腫瘤新生血管的形成密切相關(guān)。CD105在血管內(nèi)皮細(xì)胞選擇性表達(dá),作為新生血管及尚未形成血管的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物,對(duì)判斷腫瘤預(yù)后更具有優(yōu)越性,尤其對(duì)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤更有預(yù)測(cè)價(jià)值。

本研究采用免疫組化 SP法檢測(cè)喉癌組織中 COX-2及CD105的表達(dá)情況,并進(jìn)一步探討二者的相關(guān)性。為闡明喉癌的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移機(jī)制提供更多的實(shí)驗(yàn)資料,為喉癌的臨床治療和判斷預(yù)后提供新的思路和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

實(shí)驗(yàn)組:選取的30例臨床病例資料齊全的原發(fā)性喉鱗癌標(biāo)本均取自住院手術(shù)切除的患者。經(jīng)病理診斷為喉鱗癌。所有原發(fā)性喉鱗癌患者手術(shù)前均未進(jìn)行放、化療;其中男23例,女 7例,年齡 為 35～ 79歲 ,平均 57.8歲。病理分 級(jí)按 WHO分類標(biāo)準(zhǔn):高分化鱗癌13例,中分化鱗癌 9例 ,低分化鱗癌 8例。其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的為16例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的為 14例(術(shù)后病理證實(shí))。聲門上型為19例,聲門型為 11例,聲門下型為 0例。臨床分期按國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)(UICC)1997年修訂的 TNM分期標(biāo)準(zhǔn):其中Ⅰ -Ⅱ期14例,Ⅲ -Ⅳ期16例。

對(duì)照組:10例手術(shù)切除的癌旁正常組織(距腫瘤邊緣＞1.0cm),均經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)。

1.2 試劑

鼠抗人 COX-2單克隆抗體 (工作液 );鼠抗人 CD105單克隆抗體(工作液);DAB顯色試劑盒,即用型 SP試劑盒。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

常規(guī)石蠟包埋;防脫片制備;HE染色;免疫組織化學(xué)染色 (SP法,微波修復(fù) )。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn):(1)COX-2免疫組織化學(xué)染色以細(xì)胞質(zhì)和(或)核膜染色出現(xiàn)特異性棕黃色片狀或顆粒狀者為陽性細(xì)胞。每張切片在高倍顯微鏡下(400×)隨機(jī)選擇5個(gè)視野,避開腫瘤邊緣及壞死區(qū)域,計(jì)算每個(gè)視野COX-2陽性細(xì)胞率,取平均值作為該標(biāo)本的陽性細(xì)胞率。按陽性細(xì)胞所占百分比打分:0分為 ＜10%;1分為 10%-25%;2分為＞25%-50%;3分為＞ 50%。再按陽性染色細(xì)胞與背影著色相對(duì)比打分:0分為無色、1分為淡黃色、2分為棕黃色、3分為棕褐色。將兩個(gè)分值相加得出該標(biāo)本的免疫組織化學(xué)的陽性分度:0-1分為陰性;＞ 1-5分為弱陽性;＞ 5分為陽性。(2)CD105免疫組織化學(xué)染色陽性為血管內(nèi)皮細(xì)胞染成棕黃色,其中以細(xì)胞膜著色較深。微血管判斷標(biāo)準(zhǔn)及計(jì)數(shù)方法:在腫瘤區(qū)內(nèi)單個(gè)或成叢的內(nèi)皮細(xì)胞,不管成腔與否均視為單個(gè)血管,凡管腔面積＞8個(gè)紅細(xì)胞直徑,帶有較厚肌層的血管及硬化區(qū)域的血管均不計(jì)數(shù),不論腫瘤實(shí)質(zhì)區(qū)還是間質(zhì)區(qū)均為測(cè)量對(duì)象。先在低倍鏡下(10× )選取腫瘤微血管數(shù)量最豐富區(qū),在高倍顯微鏡下(400×)計(jì)算5個(gè)視野范圍微血管數(shù)目,然后取平均值,作為 MV D。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

全部資料采用 SPSS10.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 COX-2、 CD105的表達(dá)及定位情況

COX-2陽性染色主要位于癌細(xì)胞的胞質(zhì),而且血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)也有部分著色。棕黃色顆粒彌漫分布于整個(gè)胞質(zhì)或沿核膜周邊呈線狀分布。COX-2在喉癌組織中的陽性部位主要位于癌細(xì)胞浸潤(rùn)灶、喉癌角化珠和壞死灶周圍。COX-2在喉癌組織和正常組織中均有表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P ＜ 0.05)。

CD105陽性染色(棕黃色)主要位于微血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì),微血管主要見于癌間質(zhì)。并且在癌巢邊緣的 MV D強(qiáng)于中央,但大血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中未見表達(dá),CD105在喉癌組織和正常組織中均有表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。

2.2 COX-2在喉癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

見表1。

表1 喉癌組織中 COX-2表達(dá)與臨床病理參數(shù)關(guān)系

經(jīng) Fisher確切概率法統(tǒng)計(jì)分析,COX-2在喉癌中的表達(dá)與患者病理分級(jí)無關(guān)((均 P＞ 0.05);與臨床分期有關(guān),Ⅲ -Ⅳ期病例 COX-2陽性表達(dá)率高于Ⅰ -Ⅱ期病例,二者差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組 COX-2陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,二者差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。

2.3 喉癌組織與癌旁正常組織中 COX-2表達(dá)及 MV D的關(guān)系

喉癌組織中 COX-2陽性表達(dá)率為70.00%,癌旁正常組織中 COX-2陽性表達(dá)率為 20.00%,兩組相比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P ＜0.05)。通過 MVD計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn),30例喉癌組織的平均 MVD為(8.63±1.85)條 /HP;癌旁正常組織的平均MVD為(3.16± 1.02)條 /HP,兩組相比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P ＜ 0.05)。見表2。

表2 喉癌、癌旁組織中 COX-2表達(dá)及 MVD

2.4 COX-2在喉癌中的表達(dá)與 MVD的關(guān)系

根據(jù) COX-2的表達(dá)情況,將樣本分為3組。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:陰性與弱陽性比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P ＜0.05);陰性與陽性比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);弱陽性與陽性比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P ＜0.05)。表明 COX-2的表達(dá)與MVD之間具有相關(guān)性。見表3。

表3 喉癌組織中 COX-2表達(dá)與 MV D的關(guān)系

2.5 喉癌組織中 MVD與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組 MVD值高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,二者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P ＜0.05)。表明 CD105標(biāo)記的 MV D與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間具有相關(guān)性。見表4。

表4 喉癌組織中 MVD與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

3 討論

喉癌的發(fā)生一般認(rèn)為與煙酒過度及環(huán)境污染等因素引起的長(zhǎng)期炎性刺激有關(guān),而慢性肥厚性喉炎被認(rèn)為是喉癌的癌前病變之一。提示參與炎癥過程的一些因素與喉癌的發(fā)生、發(fā)展可能有關(guān)。環(huán)氧化酶是分解花生四烯酸、生成各種內(nèi)源性前列腺素過程中重要的限速酶,前列腺素作為重要的炎癥介質(zhì),具有促進(jìn)細(xì)胞增生和抑制細(xì)胞凋亡以及刺激新生血管生成等多種功能。哺乳動(dòng)物至少有兩種同工酶:COX-1和COX-2;都是完整的膜結(jié)合蛋白,COX-1是結(jié)構(gòu)型表達(dá)蛋白,被認(rèn)為是“看家基因”,在大多數(shù)組織細(xì)胞中持續(xù)低濃度表達(dá),參與維持正常的生理功能,如保護(hù)胃黏膜,腎臟血流的調(diào)節(jié)和控制血小板聚集、穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境等;COX-2是一種可誘導(dǎo)型蛋白,被認(rèn)為是“快速反應(yīng)基因”,在正常生理狀態(tài)下多數(shù)組織內(nèi)檢測(cè)不到,但在細(xì)胞受到相應(yīng)刺激后迅速合成,研究表明,在接受刺激后 COX-2的表達(dá)在24h內(nèi)可以有數(shù)十倍的增加,參與多種生理及病理過程,COX-2的表達(dá)首先在炎癥性疾病過程中被發(fā)現(xiàn)。但近幾年來,國(guó)外諸多研究表明COX-2參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,其中尤其是 COX-2與腫瘤新生血管的形成密切相關(guān)。腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管的形成,新生血管不僅為腫瘤生長(zhǎng)提供必須的營(yíng)養(yǎng)成分,同時(shí)為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)導(dǎo)致遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供通道,亦可分泌一些細(xì)胞因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。

研究發(fā)現(xiàn) COX-2在結(jié)腸癌、直腸癌、前列腺癌、膀胱癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌等中有較高表達(dá),并認(rèn)為參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。但 COX-2與喉癌關(guān)系的研究較少。本研究應(yīng)用免疫組化 SP法檢測(cè)喉癌和癌旁正常組織中 COX-2表達(dá),發(fā)現(xiàn)喉癌組織中 COX-2表達(dá)陽性率70%高于癌旁正常組織中 COX-2表達(dá)陽性率20%,兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。同時(shí)發(fā)現(xiàn) COX-2的表達(dá)位于癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中,表明 COX-2主要由癌細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生,與喉癌的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切。

Murata等[7]以蛋白印跡法、標(biāo)準(zhǔn)密度掃描技術(shù)半定量測(cè)定15例胃癌及非癌組織 COX-2的表達(dá)情況。結(jié)果表明,胃癌COX-2的表達(dá)明顯增加,且增高程度與周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和胃癌的 TNM分期有關(guān)。但有人在宮頸癌的研究中發(fā)現(xiàn)COX-2的過度表達(dá)與宮頸癌的臨床分期無關(guān)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)Ⅲ -Ⅳ期喉癌組織 COX-2陽性表達(dá)率高于Ⅰ -Ⅱ期 ,二者比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組COX-2陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,二者比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。提示較晚期的喉癌產(chǎn)生較多的COX-2以維持腫瘤的生長(zhǎng),COX-2的過度表達(dá)與喉癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究還表明 COX-2的表達(dá)與喉癌病理分級(jí)無相關(guān)性 (均P＞ 0.05),提示 COX-2并不參與喉癌的組織分化,與腫瘤的惡性程度無關(guān)。該結(jié)果與蔣代華等[12]在鼻咽癌中的研究結(jié)果一致。研究表明,COX-2可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮作用[1～3]:①促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng);②抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡;③參與腫瘤血管形成;④促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn);⑤降低放、化療的細(xì)胞毒性;⑥增強(qiáng)促癌物質(zhì)的致癌作用。當(dāng)實(shí)體腫瘤大小超過 1～ 2mm3時(shí)就需要持續(xù)不斷的新生血管生成。腫瘤新生血管的形成能力常用微血管密度(MV D)表示。腫瘤組織的 MVD與癌癥患者的預(yù)后直接相關(guān),關(guān)于喉癌的 MVD是否與預(yù)后相關(guān)有相互矛盾的研究報(bào)道,還存在不少爭(zhēng)議,這可能與血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物的不同有關(guān)。采用Ⅷ因子、CD31、CD34等泛血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物對(duì)腫瘤組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,來評(píng)價(jià)腫瘤組織中 MV D已為多數(shù)學(xué)者所應(yīng)用。CD105是一種同型二聚體的膜結(jié)合性糖蛋白,是內(nèi)皮細(xì)胞表面與增殖相關(guān)的膜抗原,在血管內(nèi)皮細(xì)胞選擇性表達(dá),主要表達(dá)于新生血管及尚未形成血管的內(nèi)皮細(xì)胞,是新生血管的標(biāo)志,推測(cè)CD105對(duì)腫瘤的微血管計(jì)數(shù)比普通的泛血管內(nèi)皮標(biāo)記物更敏感,更適應(yīng)于腫瘤組織。

Kumar等[8]用 CD34檢測(cè)乳腺癌所得的 MVD只與腫瘤大小有關(guān);而由 CD105檢測(cè)所得的 MVD卻可以成為乳腺癌病人預(yù)后的獨(dú)立性指標(biāo),能定量區(qū)別腫瘤新生血管和已存在血管。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn),同一部位正常血管 CD34染色陽性,而相同部位的新生血管 CD105染色陽性,CD34卻不著色。Akagi[10]同樣采用抗— CD34mAb及抗— CD105mAb對(duì)大腸癌的新生血管進(jìn)行標(biāo)記,結(jié)果發(fā)現(xiàn) CD34僅能使部分血管染色,沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而 CD105可以作為大腸癌新生血管有價(jià)值的標(biāo)志物。血管內(nèi)皮的高度異質(zhì)性決定了正常血管內(nèi)皮標(biāo)記物并不適應(yīng)于腫瘤組織,腫瘤生長(zhǎng)所引起的并不僅僅是血管數(shù)目的增加,還可能包括表達(dá)在血管上的多種蛋白分子的改變。理想的腫瘤新生血管評(píng)價(jià)指標(biāo),不僅要包括數(shù)目的改變,更要含有質(zhì)量的改變,只有這樣才能提高檢測(cè)的敏感度和可信度。通過比較,可以認(rèn)為 CD105是較 CD31、CD34和Ⅷ因子等泛血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物為好的一種腫瘤血管內(nèi)皮標(biāo)志物。

本研究用 CD105標(biāo)記 MVD計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn),30例喉癌組織的平均 MVD為(8.63±1.85)條 /HP,10例癌旁正常組織的平均 MVD為 (3.16± 1.02)條 /HP,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P ＜0.05),表明 CD105標(biāo)記的 MVD與喉癌的關(guān)系密切。Brewer等[9]對(duì) CD105標(biāo)記頭頸部癌新生血管的表達(dá)進(jìn)一步研究,以Ⅷ因子相關(guān)性抗原作對(duì)比,結(jié)果發(fā)現(xiàn) CD105的微血管計(jì)數(shù)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),而Ⅷ因子的微血管計(jì)數(shù)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān),本研究檢測(cè)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組平均 MV D為(11.08±1.98)條/HP,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組平均 MV D為(5.87±1.28)條/HP,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。該結(jié)果與以上研究結(jié)果一致。提示 CD105標(biāo)記的 MV D與喉癌患者淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移密切相關(guān),可能成為判斷喉癌患者預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立指標(biāo)。

COX-2的表達(dá)水平與腫瘤組織中的 MVD具有相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn),隨著喉癌組織中 COX-2表達(dá)的升高,CD105標(biāo)記的 MV D也逐漸升高,每?jī)山M比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示 COX-2過度表達(dá)可刺激喉癌組織的新生血管形成。COX-2在腫瘤組織中促進(jìn)血管形成的機(jī)理尚未完全明確,基本可概括為:(1)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生VEGF[4];(2)腫瘤組織中產(chǎn)生的 PGE2、PGF2及 TX A2等直接或間接促進(jìn)血管生成;(3)抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,促進(jìn)血管生成;(4)缺氧誘導(dǎo) COX-2促進(jìn)腫瘤血管的生成[6];(5)一氧化氮合酶(NOS)又誘導(dǎo) COX-2促進(jìn)腫瘤血管的生成[5];(6)激活基質(zhì)金屬蛋白酶(MM P)和整合素(IF)促進(jìn)腫瘤血管的生成[5]。

本研究表明 COX-2在喉癌中高表達(dá),并與腫瘤的新生血管生成密切相關(guān)。CD105標(biāo)記的 MVD與喉癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切,可能成為判斷喉癌患者預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立指標(biāo)。

本研究提示應(yīng)用特異性 COX-2抑制劑可以抑制喉癌中新生血管形成,為喉癌患者特別是晚期患者的治療提供新途徑,提高喉癌患者的生存率。CD105主要表達(dá)于新生血管,提示 CD105標(biāo)記的微血管密度可為喉癌的放療敏感性提供指標(biāo)。推測(cè) COX-2抑制劑與放療聯(lián)合應(yīng)用或許可以取代手術(shù)治療,保留喉癌患者的喉功能。

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