肖江衛(wèi) 王崇樹 魏壽江 王 城 周 彤 李勁東 彭 勇

芬戈莫德(FTY720)是 1種小分子的免疫調(diào)節(jié)劑,它是從冬蟲夏草中分離出來的活性成分 ISP-1,經(jīng)過化學改造而得來[1]。目前已臨床應用于抑制實體器官的移植免疫排斥。最近的實驗研究發(fā)現(xiàn),FTY720還具有多種腫瘤抑制效應,如抑制乳腺癌的生長和轉移[2]、抑制前列腺癌的侵襲[3]和誘導人膀胱癌的凋亡[4]等。但國內(nèi)外 FTY720對肝癌細胞的抑制效應尚研究不多,而且機理未明。本實驗通過 FTY720對裸鼠肝移植瘤的抑制作用進行研究,并進一步闡明其分子機制,從而為臨床治療肝癌提供理論基礎和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物和試劑 選取健康、雄性、體重 20 g的 SPF級裸鼠 32只,裸鼠由香港大學實驗動物中心提供。增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、Caspase 3以及 Phospho-Akt(Ser473)單克隆抗體(均購自美國 eBioscience公司)、原位細胞 TUNEL檢測試劑盒(購自瑞士 Roche公司)等。

1.1.2 實驗分組 將種植腫瘤 1周后的荷瘤裸鼠隨機分入 3組,每組各 10只。3個組分別為:生理鹽水對照組、FTY720治療組 (5mg/kg)、FTY720治療組(10mg/kg)。

1.2 實驗方法

1.2.1 裸鼠肝臟移植瘤的制備[5]將體外培養(yǎng)的MHCC-97H(metastatic human hepatocellular carcinoma 97H)細胞系 1×107注射于裸鼠皮下,待腫瘤生長至1.0 cm左右,在無菌含 DMEM培養(yǎng)皿中將腫瘤切至0.1cm左右大小均勻的瘤塊,然后將瘤塊種植入裸鼠的左肝外葉,植入腫瘤后 1周的裸鼠再進行藥物治療。

1.2.2 常規(guī)組織病理學及免疫組織化學檢查 常規(guī)蘇木精-伊紅染色(HE staining),顯微鏡下觀察腫瘤的組織形態(tài)學改變;采用免疫組織化學方法,檢測增殖細胞核抗原 (PCNA)、Caspase 3、Phospho-Akt(Ser473)表達水平變化。隨機選取 3個高倍鏡視野(400×)計數(shù)陽性細胞占總腫瘤細胞的百分比,并比較各組陽性細胞百分比的差異。

1.2.3 TUNEL法檢測移植瘤凋亡水平變化 通過原位細胞凋亡檢測試劑盒(TUNEL法)檢測移植瘤凋亡水平變化。結果判定:陽性反應為胞核有棕黃色顆粒沉積,并隨機選取 3個高倍鏡視野(400×)計數(shù)凋亡細胞占總腫瘤細胞的百分比,并做比較。

1.2.4 Phospho-Akt、Caspase3mRNA表達水平變化的檢測 采用 Trizol總 RNA提取法提取總 RNA。然后將 3μg總 RNA逆轉錄成 cDNA。取 2μl cDNA加入25μl的 PCR擴增體系內(nèi),按表 1中反應條件進行。取 4μl擴增產(chǎn)物在質(zhì)量濃度為 15 g/l的瓊脂糖凝膠(內(nèi)含 0.5μg/m l的溴化乙錠)電泳,時間 20～25 min,電壓 100V,采用 Genesnap凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描擴增產(chǎn)物電泳條帶的密度,計算產(chǎn)物的相對量:產(chǎn)物相對量 =產(chǎn)物電泳條帶密度/β-actin產(chǎn)物電泳條帶密度。

表1 Phospho-Akt和 Caspase 3的引物序列及反應條件

1.2.5 腫瘤體積測定及比較 用游標卡尺測定腫瘤最長徑 L和最短徑 W,以公式 V=L×W2/2計算腫瘤體積,計算出各組腫瘤的平均腫瘤體積并進行比較。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用 SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行單向方差分析(One-way ANOVA),陽性細胞所占百分比的比較采用χ2檢驗,腫瘤平均體積采用 t檢驗。

2 結果

2.1 免疫組織化學

免疫組織化學結果顯示:磷酸化 Akt蛋白(Phospho-Akt)在 FTY720治療組(5mg/kg和 10 mg/kg)表達水平低于生理鹽水對照組(P均 ＜0.05),而Caspase-3在 FTY 720治療組 (5mg/kg和 10mg/kg)表達水平明顯高于生理鹽水對照組(P均 ＜0.05),而增殖細胞核抗原(PCNA)在 FTY720治療組(5 mg/kg和 10mg/kg)表達水平要低于對照組 (P均 ＜0.05),提示FTY720可抑制激活的 PI3K-Akt信號通路,上調(diào)Caspase-3表達水平,誘導增強癌細胞凋亡,同時抑制降低腫瘤細胞增殖水平,見圖 1～3。

圖1 3組磷酸化 Akt蛋白表達比較

圖2 3組 Caspase-3蛋白表達比較

2.2 TUNEL法凋亡檢測結果

TUNEL法凋亡檢測結果顯示,FTY720治療組(5 mg/kg和 10mg/kg)凋亡水平明顯上調(diào),遠遠高于生理鹽水治療組(P＜0.05和 P＜0.001),尤以 10mg/kg更為顯著,見圖 4。

2.3 腫瘤組織中 Phospho-Akt和 Caspase-3的 mRNA表達情況

根據(jù) RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳圖繪制直方圖(圖5)。FTY 720治療組(5mg/kg和 10mg/kg)的 Phospho-AktmRNA表達水平明顯受到抑制(P均 ＜0.05),而Caspase-3 mRNA表達水平明顯高于生理鹽水對照組(P均 ＜0.05),提示 FTY720可以明顯地抑制激活的PI3K-Akt信號通路,上調(diào) Caspase-3表達,促進腫瘤細胞凋亡。

2.4 治療結束后各組腫瘤體積的比較

采用 FTY720治療 1個月后,處死裸鼠,并用標尺測量了腫瘤的長徑和短徑,以公式 V=L×W2/2計算腫瘤體積并做比較。由圖 6可見,與生理鹽水治療組比較,FTY720治療組(5mg/kg和 10 mg/kg)明顯地抑制了腫瘤生長(P均 ＜0.05)。

圖3 3組PCNA蛋白表達比較

圖4 對照組和 FTY 720治療組TUNEL法陽性細胞百分比比較

圖5 對照組和治療組的磷酸化 Akt和 Caspase-3m RNA表達水平比較

圖6 對照組和FTY720治療組腫瘤平均體積比較

3 討論

原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是目前全世界第三大致死性腫瘤,也是我國最常見的惡性腫瘤之一。傳統(tǒng)肝臟部分切除手術一直是治療肝癌的首選方法,但肝癌的總體手術切除率僅有 20%左右,術后總體生存率也一直不高,其 5年生存率介于 13%～46%,術后容易復發(fā)和轉移,難以實現(xiàn)根治[6]。

FTY720作為最近幾年開發(fā)出來用于免疫抑制的藥物,現(xiàn)已廣泛應用于臨床抗器官移植免疫排斥。但其腫瘤抑制效應最近才被科學家所發(fā)現(xiàn),人們已發(fā)現(xiàn)它對多種腫瘤有抑制作用。Terence等[5]證實 FTY720對于多種肝癌腫瘤細胞系有明顯地抑制作用。我們的實驗結果也顯示 FTY720對于人高轉移性地肝癌細胞系 MHCC-97H移植瘤具有明顯地抑制作用,能通過誘導腫瘤細胞凋亡,減緩和抑制移植瘤的生長。FTY720的治療劑量為 5 mg/kg時,即可達到 4倍左右的腫瘤體積抑制效應,而當劑量提高到 10mg/kg是可以達到10倍左右的抑制效應,而裸鼠可以完全耐受治療,取得比較滿意地腫瘤治療效果。

有研究發(fā)現(xiàn) FTY720能明顯地誘導腫瘤細胞凋亡,其誘導腫瘤細胞凋亡與 Caspase-3、Caspase8以及Bid的活化密切相關,而并不依賴于 Fas途徑,但對bcl-2具有依從性,bcl-2的過量表達可以抑制凋亡[7]。Matsuoka等[8]發(fā)現(xiàn) FTY720可以誘導人 T細胞白血病腫瘤細胞系 Jurkat細胞系出現(xiàn) G0/G1期生長抑制,它通過促進 Akt、Bad和核糖體 p70S6激酶脫磷酸化,同時使 PPA2或 PPA2樣的磷酸酶被激活,進而促進經(jīng)由線粒體的細胞凋亡。Azuma等[2]研究發(fā)現(xiàn) FTY720在抑制乳腺癌細胞系生長過程是呈劑量依賴關系的,FTY720治療后改變了腫瘤細胞的骨架結構,整合素明顯減少,這些改變將干擾腫瘤細胞的黏附,特別是對層黏連蛋白的黏附,從而阻斷了腫瘤細胞在靶組織中的著床、播散和轉移。此外,FTY 720還可能是通過抑制細胞外的信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)來誘導腫瘤細胞凋亡[9]。FTY720的抗腫瘤作用與目前常用的化療藥物作用機制不同。FTY720誘導淋巴細胞凋亡而不影響造血系統(tǒng)其它細胞系如粒細胞、紅細胞和巨噬細胞,也不抑制骨髓,說明誘導的凋亡并不是基于細胞毒作用的,FTY720可能激活了存在于腫瘤細胞和淋巴細胞之間的某種凋亡途徑。

近年來發(fā)現(xiàn),PI3K和其下游分子蛋白激酶 B(PKB或 Akt)所組成的信號通路與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。該通路調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖和存活,其活性異常不僅能導致細胞惡性轉化,而且與腫瘤細胞的遷移、黏附、腫瘤血管生成以及細胞外基質(zhì)的降解等相關[10]。細胞凋亡是控制過度增殖的 1種正常細胞功能,癌細胞具有多種抑制凋亡、延長其存活的機制。Akt主要作用于抗凋亡通路,顯性負效應 Akt通過多條途徑誘導抑制凋亡,而腫瘤細胞中 PI3K-Akt信號通路常處于激活狀態(tài),腫瘤細胞的凋亡受到抑制,處于持續(xù)增殖無控制狀態(tài)。我們的研究結果表明 FTY720確實可以下調(diào)處于激活 PI3K-Akt信號通路,促使蛋白激酶脫磷酸化,從而釋放腫瘤細胞的凋亡抑制狀態(tài),促進和誘導腫瘤細胞凋亡。同時能夠誘導活化 Caspase-3,表現(xiàn)出明顯地抗腫瘤效應。但 FTY720具體分子機制仍不完全明了,還需要進一步地深入研究。

總之,FTY720不僅具有免疫抑制作用,而且還具有抗腫瘤效應。FTY720不僅可以用于抗器官移植術后的免疫排斥反應,而且能抑制移植術后腫瘤的復發(fā)和轉移,這對肝癌肝移植患者更具重要意義。

[1] Napoli KL.The FTY 720 story〔J〕.Ther Drug Monit,2000,22(1):47.

[2] Azuma H,Takahara S,Ichimaru N,et al.Marked prevention of tumor grow th and metastasis by a novel immunosuppressive agent,FTY 720,in mouse breast cancer models〔J〕.Cancer Res,2002,62(5):1410.

[3] Chua CW,Chiu YT,Yuen HF,et al.Suppression of androgen-independent prostate cancer cell aggressiveness by FTY 720:validating Runx2 as a potential antimetastatic drug screening platform〔J〕.Clin Cancer Res,2009,15(13):4322.

[4] Azuma H,Takahara S,Horie S,et al.Induction of apop tosis in human bladder cancer cells in vitro and in vivo caused by FTY 720 treatment〔J〕.JUrol,2003,169(6):2372.

[5] Lee TK,Man K,Ho JW,et al.FTY720:a promising agent for treatment of metastatic hepatocellular carcinoma〔J〕.Clin Cancer Res,2005,11(23):8458.

[6] El-Serag H B,Marrero JA,Rudolph L,etal.Diagnosis and treatment of hepatocellular carcinoma〔J〕.Gastroenterology,2008,134(6):1752.

[7] Ubai T,Azuma H,Kotake Y,et al.FTY720 induced Bcl-associated and Fas-independent apoptosis in human renal cancer cells in vitro and significantly reduced in vivo tumor growth in mouse xenograft〔J〕.Anticancer Res,2007,27(1A):75.

[8] Matsuoka Y,Nagahara Y,Ikekita M,et al.A novel immunosupp ressiveagent FTY 720 induced Akt dephosphorylation in leukem ia cells〔J〕.Br JPharmacol,2003,138(7):1303.

[9] Azuma H,Horie S,Muto S,etal.Selective cancer cellapoptosis induced by FTY 720;evidence for a Bcl-dependent pathway and impairment in ERK activity〔J〕.Anticancer Res,2003,23(4):3183.

[10] 孫曉杰,黃常志.PI3K-Akt信號通路與腫瘤〔J〕.世界華人消化雜志,2006,14(3):306.