李 昕 周 靜 楊昌英

(1.三峽大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,湖北 宜昌 443002;2.三峽旅游職業(yè)技術(shù)學(xué)院,湖北 宜昌 443002)

生物傳感器是一種分析檢測(cè)裝置,它將某種生物材料、生物衍生材料或仿生材料緊密連接或結(jié)合到生化轉(zhuǎn)換器或轉(zhuǎn)換微系統(tǒng)上[1].各種類型的生物傳感器相應(yīng)問世,并被應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、食品安全、畜牧獸醫(yī)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、發(fā)酵工程、軍事和科學(xué)研究等諸多領(lǐng)域[2-3],生物傳感器具有高靈敏度、高選擇性、分析快捷、操作簡(jiǎn)單和儀器可集成化、微型化的特點(diǎn),應(yīng)用前景非常廣闊,極具研究開發(fā)意義.

細(xì)胞色素C幾乎存在于所有的原核生物和真核生物之中,作為細(xì)胞凋亡的信息物質(zhì),在研究病理學(xué)、藥理學(xué)以及線粒體變化的過程中具有非常重要的作用.細(xì)胞色素C作為一種重要的生物電子載體,在生物體內(nèi)可以發(fā)生可逆的氧化還原反應(yīng),但卻不能在金屬電極上直接進(jìn)行可逆的電化學(xué)反應(yīng)[4].細(xì)胞色素C的這種電化學(xué)反應(yīng)被稱之為直接電化學(xué).繼此之后,細(xì)胞色素C的電化學(xué)反應(yīng)得到更加深入的研究[5].已有報(bào)道用細(xì)胞色素C作為敏感元件監(jiān)測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中超氧化物的產(chǎn)量[6].對(duì)苯二胺(p-Phenylenediamine,簡(jiǎn)稱PPD),也是一種有廣泛應(yīng)用的中間體,主要用于聚合物制品、紡織品和染發(fā)劑行業(yè),也可用于制取橡膠防老劑和照片顯影劑,另外對(duì)苯二胺還是常用的檢驗(yàn)鐵和銅的靈敏試劑[7].在電化學(xué)領(lǐng)域中,PPD可以作為單體在不同條件下通過化學(xué)或電化學(xué)方法聚合為導(dǎo)電聚合物或非導(dǎo)電聚合物[8].本文通過自組裝法和吸附法兩種不同方法制備了修飾電極,運(yùn)用循環(huán)伏安和交流阻抗,探究了細(xì)胞色素C修飾電極檢測(cè)過氧化氫和亞硝酸鈉以及對(duì)苯二胺電化學(xué)和酶催化反應(yīng)產(chǎn)物引起的的電極鈍化.

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

谷氨酸(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司),EDC(上海共價(jià)有限公司),其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純,1mol?L-1H2SO4溶液,PBS(pH=7.0)緩沖溶液,0.02mol?L-1L-谷氨酸,Fe電解液(5.0mmol?L-1K3Fe(CN)6+5.0 mmol?L-1K4Fe(CN)6+0.1 mmol?L-1KCl)溶液:依次稱取 1.6460 g K3Fe(CN)6,2.1142g K4Fe(CN)6,7.4587g KCl溶解在200mL的水中,然后定容至1000 mL.

1.2 主要儀器

AUTOLAB-PGSTAT12電化學(xué)工作站(荷蘭),SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器(上海),KQ-100型超聲波清洗器(昆山),DHG-9076A型電熱恒溫鼓風(fēng)干照箱(上海).

1.3 修飾電極的制備

1.3.1 自組裝法修飾電極

裸電極處理:將玻碳電極在拋光布上拋光成鏡面,在硫酸∶過氧化氫(7∶3)的混合液中煮沸5min,最后在超聲波水浴中用二次石英重蒸水徹底清洗.

電極活化:在經(jīng)過電極預(yù)處理后還需要用電化學(xué)方法進(jìn)行電極活化.取25 mL燒杯,加入15mL 1 mol?L-1H2SO4溶液,在室溫下,采用電化學(xué)工作站,用循環(huán)伏安法活化,掃描電位區(qū)間為0～+1.5V,掃描速度為50mV/s,掃描圈數(shù)為20圈.

谷氨酸修飾電極:谷氨酸通過電化學(xué)方法在電極上聚合.在25mL燒杯中加入15 mL谷氨酸溶液,在室溫下,采用電化學(xué)工作站,掃描電位區(qū)間為-0.8V～+1.8V,掃描速度為100 mV/s,掃描圈數(shù)為10圈.通過電化學(xué)聚合,電極表面上形成一層聚L-谷氨酸薄膜,即制成PGLA-GCE電極.

細(xì)胞色素C修飾電極:細(xì)胞色素C自組裝法修飾電極是采用靜電結(jié)合法,谷氨酸上的羧基與細(xì)胞色素C上的氨基通過靜電吸引結(jié)合,以使細(xì)胞色素C附于電極表面.

在1.5mL離心管,用移液槍加入100μ L細(xì)胞色素C 溶液和200μ L和PBS,在4℃下,放置12h.通過此步驟,電極表面上形成一層聚L-谷氨酸和細(xì)胞色素C組合的薄膜,即制成CYTC-PLGA-GCE電極.

1.3.2 吸附法修飾電極

裸電極預(yù)處理步驟與自組裝法修飾電極一樣.細(xì)胞色素C吸附法修飾電極是利用殼聚糖把細(xì)胞色素C固定于電極表面.用氮?dú)鈱⒔?jīng)過預(yù)處理的玻碳電極表面吹干,用移液槍取一定量 0.5%殼聚糖與1mmol?mL-1細(xì)胞色素C混合溶液滴于電極表面,于空氣中倒置電極4h以上.在電極表面滴加Nifion溶液形成一層Nifion膜,放置5h后將電極置于PBS溶液中2h.

1.3.3 電化學(xué)測(cè)試

電化學(xué)測(cè)試在電化學(xué)工作站上進(jìn)行.分別以修飾電極(裸電極)為工作電極,Pt電極為對(duì)電極,甘汞電極為參比電極,選擇合適電解液(主要為Fe(CN)63-/4-與KCl混合溶液和PBS),進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè).

(1)循環(huán)伏安掃描.取25 mL燒杯,加入15 mL Fe(CN)63-/4-與KCl混合溶液作為電解液,組裝電解池,掃描范圍-0.2～0.6V,掃描速度100mV/s.

(2)PBS中信號(hào)響應(yīng).取25mL燒杯,加入15mL PBS,組裝電解池,選擇合適的掃描范圍(本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)-1.2～0.4V這一范圍效果較好)和掃描速度進(jìn)行循環(huán)伏安掃描.修飾完電極之后需要采用不同掃速進(jìn)行掃描 ,一般為 20、50、100、150、200、250、300 和350mV/s.

1.3.4 細(xì)胞色素C修飾電極的催化性能

(1)自組裝法修飾電極的催化性能.細(xì)胞色素C修飾電極對(duì)過氧化氫的響應(yīng):取25 mL燒杯,加入15 mL PBS(pH=7.4),以細(xì)胞色素C修飾電極為工作電極組裝電解池,逐步加入一定量過氧化氫,每加入一次之后進(jìn)行循環(huán)伏安掃描.掃描范圍為-1.2～0.4 V,掃描速度200mV/s.在同樣條件下對(duì)有聚合谷氨酸的電極進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn).

細(xì)胞色素C修飾電極對(duì)亞硝酸鈉的響應(yīng):取25 mL燒杯,加入15mL PBS(pH=5),以細(xì)胞色素C修飾電極為工作電極組裝電解池,逐步加入一定量亞硝酸鈉,每加入一次之后進(jìn)行循環(huán)伏安掃描.掃描范圍為-1.2～0.4V,掃描速度200 mV/s.在同樣條件下對(duì)有聚合谷氨酸的電極進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn).

(2)吸附法修飾電極的催化性能.細(xì)胞色素C修飾電極在PBS中的響應(yīng):取25mL燒杯,加入15 mL PBS(pH=7.4).以細(xì)胞色素C修飾電極為工作電極組裝電解池,進(jìn)行循環(huán)伏安掃描.掃描范圍為-1.0～0.4V,掃描速度100mV/s.

細(xì)胞色素C修飾電極在含對(duì)苯二胺電解質(zhì)溶液中的鈍化:取25 mL燒杯,加入 15 mL PBS(pH=7.4)和150ul PPDA.以細(xì)胞色素C修飾電極為工作電極組裝電解池,進(jìn)行循環(huán)伏安掃描.掃描范圍為-0.6～0.5V,掃描速度 100 mV/s,掃描30圈.在同樣條件下對(duì)裸電極進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn).

2 結(jié)果分析

2.1 自組裝法修飾電極

2.1.1 裸GCE電極的信號(hào)表征

圖1為玻碳電極在5 mM Fe(CN)63-/4-和0.1 MKCl混合溶液構(gòu)成的電解質(zhì)溶液中的循環(huán)伏安譜.掃描速度100mV/s,在0.236V和0.150V處出現(xiàn)一對(duì)可逆的氧化還原峰,峰電位差ΔEp=86mV.在理想狀態(tài)下,裸電極的峰電位差為59mV,在實(shí)驗(yàn)條件下應(yīng)盡可能接近此值.實(shí)驗(yàn)中要求此值小于90mV,才可使用電極,否則要重新處理電極,直到符合要求為止.圖2為玻碳電極在濃度為0.02mol?L-1磷酸緩沖溶液中的循環(huán)伏安.圖中沒有明顯氧化還原峰,此圖形用于與細(xì)胞色素C修飾電極所得循環(huán)伏安圖做比對(duì).

圖1 玻碳電極的循環(huán)伏安譜

圖2 玻碳電極磷酸緩沖溶液中的循環(huán)伏安

2.1.2 谷氨酸在電極表面的聚合

通過電化學(xué)聚合法所得循環(huán)伏安如圖3所示,圖形為聚合過程掃描10圈的組合圖.由圖可知隨著聚合的進(jìn)行,-0.12V處峰值逐漸增大,表明谷氨酸在電極上逐漸聚合.實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)谷氨酸的濃度對(duì)聚合效果有很大影響.當(dāng)谷氨酸濃度過小時(shí),有聚合谷氨酸的電極在PBS中進(jìn)行響應(yīng)得不到明顯的氧化還原峰,說明聚合于電極表面的谷氨酸的量較小,聚合效果較差.此時(shí)應(yīng)該加大谷氨酸的量,選擇一個(gè)合適的濃度值.

圖3 電化學(xué)聚合法所得循環(huán)伏安圖

有聚合谷氨酸的電極在PBS中循環(huán)伏安響應(yīng),如圖4所示.由圖可知在-0.35V和-0.05V處出現(xiàn)一對(duì)明顯的可逆氧化還原峰.有聚合谷氨酸的電極和裸玻碳電極在含F(xiàn)e電解質(zhì)液中的循環(huán)伏安圖,如圖5所示.由圖可知,有聚合谷氨酸的電極相較裸玻碳電極氧化還原峰電流略微降低.

圖4 聚合谷氨酸的電極在PBS中循環(huán)伏安響應(yīng)

圖5 聚合谷氨酸的電極和裸玻碳電極的電化學(xué)性能

2.1.3 細(xì)胞色素C修飾電極

(1)細(xì)胞色素C修飾電極的信號(hào)表征

圖6中各曲線代表一定掃速時(shí)細(xì)胞色素C修飾電極在PBS中循環(huán)伏安響應(yīng)圖.圖中顯示,在-0.4 V和0.05V處出現(xiàn)一對(duì)明顯的可逆氧化還原峰.這對(duì)氧化還原峰為電極表面細(xì)胞色素C活性中心的氧化還原峰.圖7為裸玻碳電極、有聚合谷氨酸的電極和細(xì)胞色素C修飾電極在含F(xiàn)e電解質(zhì)液中的循環(huán)伏安比對(duì)圖.圖中顯示細(xì)胞色素C修飾電極相較聚合有谷氨酸的電極氧化還原峰電流進(jìn)一步降低,這說明細(xì)胞色素C已經(jīng)修飾于電極之上,且經(jīng)過細(xì)胞色素C修飾電極,電極表面阻抗進(jìn)一步增大.

圖6 細(xì)胞色素C修飾電極在PBS中循環(huán)伏安響應(yīng)

(2)細(xì)胞色素C修飾電極的催化性能

圖7 修飾電極在含F(xiàn)e電解質(zhì)液中的循環(huán)伏安

圖8 細(xì)胞色素C修飾電極對(duì)過氧化氫的響應(yīng)

①修飾電極對(duì)過氧化氫的響應(yīng).細(xì)胞色素C修飾電極對(duì)過氧化氫的響應(yīng)見圖8.圖中顯示氧化峰消失,在-0.4V處出現(xiàn)一還原峰,且在一定的范圍內(nèi),隨著加入過氧化氫的量不斷增加,還原峰增大.當(dāng)加入過氧化氫濃度增大到一定程度時(shí)還原峰減小.圖9為有聚合谷氨酸的電極對(duì)過氧化氫的響應(yīng)圖.圖中顯示氧化峰消失,在-0.35V處出現(xiàn)一明顯還原峰,且在一定范圍內(nèi),隨著加入過氧化氫的量不斷增加,還原峰增大.當(dāng)加入過氧化氫濃度增大到一定程度時(shí)還原峰減小.表明在一定范圍內(nèi),有聚合谷氨酸的電極可以用于檢測(cè)過氧化氫,而且效果比較明顯.比較有聚合谷氨酸的電極和細(xì)胞色素C修飾電極對(duì)過氧化氫的響應(yīng)圖可知,谷氨酸修飾電極對(duì)過氧化氫的反應(yīng)要明顯一些.因此若要檢測(cè)過氧化氫,可直接使用谷氨酸修飾電極,實(shí)驗(yàn)方案更為簡(jiǎn)單,且價(jià)格相對(duì)低廉.

圖9 有聚合谷氨酸的電極對(duì)過氧化氫的響應(yīng)

②修飾電極對(duì)亞硝酸鈉的響應(yīng).在酸性條件下,亞硝酸鈉發(fā)生歧化反應(yīng)生成NO.在圖10中,隨著亞硝酸鈉的加入,細(xì)胞色素C修飾電極對(duì)亞硝酸鈉的循環(huán)伏安響應(yīng)圖還原峰逐漸增加.由圖可知,加入亞硝酸鈉后,亞硝酸鈉在溶液中反應(yīng)生成一氧化氮,使得氧化還原電流增加.

圖10 細(xì)胞色素C修飾電極對(duì)亞硝酸鈉的循環(huán)伏安響應(yīng)(左圖為局部放大)

有聚合谷氨酸的電極在PBS中對(duì)不斷加入亞硝酸鈉響應(yīng)圖(圖11)譜沒有發(fā)生明顯變化,說明有聚合谷氨酸的電極對(duì)一氧化氮沒有明顯反應(yīng).對(duì)照試驗(yàn)表明細(xì)胞色素C修飾電極對(duì)亞硝酸鈉的響應(yīng)是由于細(xì)胞色素C的催化作用.

圖11 聚合谷氨酸的電極在PBS(pH=5)中對(duì)不斷加入亞硝酸鈉響應(yīng)圖譜

(3)吸附法修飾電極

①細(xì)胞色素C修飾電極在PBS中的響應(yīng).用自組裝法修飾電極在PBS中的響應(yīng)所得循環(huán)伏安圖在-0.4處出現(xiàn)一明顯峰.此處用吸附法修飾電極,相應(yīng)循環(huán)伏安圖在相同位置出現(xiàn)一對(duì)氧化還原峰,而且出峰效果相對(duì)較好.但圖形整體對(duì)稱性不明顯,不同的電極修飾方法所表現(xiàn)出的電化學(xué)性質(zhì)存在著一定的差別.

圖12 細(xì)胞色素C修飾電極在PBS中的響應(yīng)

②細(xì)胞色素C修飾電極在含對(duì)苯二胺電解質(zhì)溶液中的鈍化.裸玻碳電極在含對(duì)苯二胺的電解質(zhì)溶液的循環(huán)伏安見圖13(a),隨著圈數(shù)的不斷增加,氧化還原峰逐漸減小,最后消失.在溶液中,對(duì)苯二胺氧化態(tài)物質(zhì)與還原態(tài)物質(zhì)相結(jié)合,在電極表面形成一層膜,阻礙電子傳遞,使得氧化還原峰逐漸減小.細(xì)胞色素C具有一定的電化學(xué)催化活性,圖13(b)經(jīng)細(xì)胞色素C修飾的電極在相同條件下沒有出現(xiàn)電極鈍化現(xiàn)象,在掃了30圈之后氧化還原峰沒有明顯減小.細(xì)胞色素C作為一種蛋白酶,能使對(duì)苯二胺處于氧化狀態(tài),從而防止電極表面膜的形成,避免電極鈍化的發(fā)生.由圖可觀察到在-0.4V出現(xiàn)一還原峰,但隨著圈數(shù)的增加,峰值逐漸減小并消失.這可能是電極表面結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定的變化,使得細(xì)胞色素C活性中心被覆蓋,從而其相應(yīng)的電化學(xué)反應(yīng)受到抑制.相關(guān)文獻(xiàn)在探討酶催化作用對(duì)修飾電極在含對(duì)苯二胺電解質(zhì)溶液中鈍化情況時(shí)指出,所得循環(huán)伏安圖顯示一對(duì)新的氧化還原峰.這對(duì)氧化還原峰的存在是由于溶液中形成了可溶性的對(duì)苯二胺低聚物.

圖13 裸玻碳電極(a)和細(xì)胞色素 C修飾電極(b)在對(duì)苯二胺的電解質(zhì)溶液的循環(huán)伏安

(4)影響修飾電極鈍化的因素

圖14中每一條曲線表示一種對(duì)苯二胺濃度下細(xì)胞色素C修飾電極循環(huán)伏安圖.由圖可知對(duì)苯二胺濃度越大,氧化還原值越大.這說明溶液中電極反應(yīng)形成的物質(zhì)有助于電子傳遞.

圖14 PPDA濃度對(duì)修飾電極鈍化的影響

3 結(jié) 論

(1)聚合谷氨酸的電極對(duì)過氧化氫具有一定的響應(yīng),所得循環(huán)伏安圖在-0.35V顯示一個(gè)還原峰,且在一定的范圍內(nèi),隨著加入過氧化氫的量不斷增加,還原峰增大.在一定范圍內(nèi),有聚合谷氨酸的電極可以用于檢測(cè)過氧化氫,而且效果比較明顯.聚合谷氨酸的電極對(duì)一氧化氮沒有明顯反應(yīng).

(2)細(xì)胞色素C修飾電極對(duì)過氧化氫響應(yīng)與有聚合谷氨酸的電極對(duì)過氧化氫的反應(yīng)相似.與細(xì)胞色素C修飾電極相比聚合谷氨酸的電極對(duì)過氧化氫的反應(yīng)要明顯.可直接使用谷氨酸修飾電極測(cè)過氧化氫,實(shí)驗(yàn)方案更為簡(jiǎn)單,且價(jià)格相對(duì)低廉.細(xì)胞色素C修飾電極對(duì)亞硝酸鈉有反應(yīng).隨著亞硝酸鈉的加入,細(xì)胞色素C修飾電極對(duì)亞硝酸鈉的循環(huán)伏安響應(yīng)圖還原峰逐漸增加.

(3)裸電極在含有中發(fā)生鈍化,細(xì)胞色素C修飾電極可以避免對(duì)苯二胺電解質(zhì)溶液對(duì)電極的鈍化.在濃度一定的對(duì)苯二胺溶液中,隨著掃速增大,電極鈍化速度減慢.在不同濃度的對(duì)苯二胺溶液中進(jìn)行試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)對(duì)苯二胺濃度越大,電極鈍化速度越快.

[1］左少華.電化學(xué)生物傳感器的制備和應(yīng)用研究[D].上海:華東理工大學(xué),2008.

[2］李業(yè)梅,代 月.生物傳感器的應(yīng)用和發(fā)展趨勢(shì)[J].鄖陽師范高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào),2004,24(3):42-45.

[3］姜 燕.導(dǎo)電高聚物合成及生物傳感器研究[D].揚(yáng)州:揚(yáng)州大學(xué),2007.

[4］謝 英.血紅蛋白在膜修飾電極的電化學(xué)行為及其信息分析[D].石家莊:河北師范大學(xué),2007.

[5］周偉舫.電化學(xué)測(cè)量[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1985.

[6］曹楚南,張鑒清.電化學(xué)阻抗譜導(dǎo)論[M].北京:科學(xué)出版社,2002.

[7］田 娜.金/席夫堿自組裝單層膜電化學(xué)行為研究[D].石家莊:河北師范大學(xué),2002.

[8］Shan Wenjing,He Pingli,Hu Naifei.Electrocatalytic Reduction of Nitric Oxide and Other Substrates on Hydrogel Triblock Copolymer Pluronic Films Containinghemoglobin or Myoglobin Based on Proteindirect Electrochemistry[J].Electrochimica Acta.2005,51:432-440.