李華，李明，鐘雪梅，晁衍明（.第三軍醫(yī)大學(xué)軍職干休所，重慶市 400038；.山東肥城市桃園中心衛(wèi)生院，肥城市 7609）

復(fù)方心安軟膠囊由丹參、三七、銀杏葉、川芎、甘草等8味中藥組成，具有活血化瘀、行氣止痛、改善微循環(huán)等功效?？捎糜跉鉁鲆鸬男乇?、胸悶、心悸及多種中風(fēng)后遺癥。該制劑為顆粒劑改劑型而來(lái)，原質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)有含量測(cè)定項(xiàng)目。為更好地控制該制劑質(zhì)量，本研究對(duì)該制劑中丹參、三七、銀杏葉等3味藥進(jìn)行薄層定性鑒別研究，以丹參有效成分丹參素鈉為指標(biāo)成分進(jìn)行了含量測(cè)定研究[1，2]。結(jié)果表明，所建標(biāo)準(zhǔn)可用于本制劑的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1100型高效液相色譜（HPLC）儀，包括DAD檢測(cè)器、ChemStation色譜工作站（美國(guó)Agilent公司）；LGJ-18型冷凍干燥機(jī)（北京四環(huán)科學(xué)儀器廠(chǎng)）；Laborota 4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)Heidolph公司）；SHB-95型循環(huán)水式真空泵（鄭州華中儀器廠(chǎng)）；AE 163型十萬(wàn)分之一電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ-500B型超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）。

復(fù)方心安軟膠囊（中國(guó)人民解放軍海軍總醫(yī)院制劑室提供，批號(hào)：080610、080727、080822、080923、081010）；丹參素鈉、丹參酮ⅡA、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為110855-200101、110766-200214、110704-200220、110745-200312、865-9601、0862-200004）；乙腈（色譜純，美國(guó)Fisher公司）；水為超純水（Milli-Q純水儀制得），其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 丹參的TLC鑒別[3]取本品內(nèi)容物0.5 g、不含丹參的陰性樣品0.5 g，分別加乙醚20 mL，超聲5 min，濾過(guò)，濾液揮干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，作為供試品溶液及陰性對(duì)照溶液；另取丹參酮ⅡA加乙酸乙酯制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-醋酸乙酯（19∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加熱20 min。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置，顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無(wú)干擾。丹參的TLC見(jiàn)圖1。

2.1.2 三七的TLC鑒別 取本品內(nèi)容物0.5 g、不含三七的陰性樣品0.5 g，分別加甲醇20 mL，加熱回流20 min，放冷，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL，微熱使溶解，加水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇提取液，用氨試液提取2次，每次20 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液及陰性對(duì)照溶液；另取人參皂苷Rb1和三七皂苷R1對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL各含1 mg的混合溶液，作為混合對(duì)照品溶液。吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）10℃以下放置12 h的下層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴10%硫酸乙醇溶液，于110℃加熱10 min，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與混合對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無(wú)干擾。三七的TLC見(jiàn)圖2。

2.1.3 銀杏葉的TLC鑒別 取本品內(nèi)容物0.5 g、不含銀杏葉的陰性樣品0.5 g，分別加乙酸乙酯超聲提取2次，每次30 mL，蒸干，殘?jiān)?5%乙醇5 mL溶解，置已處理好的聚酰胺柱上，用5%乙醇40 mL洗脫，收集洗脫液，蒸去乙醇，殘?jiān)? mL丙酮溶解，作為供試品溶液及陰性對(duì)照溶液；另取銀杏內(nèi)酯A和銀杏內(nèi)酯B對(duì)照品，加丙酮制成每1 mL各含0.65 mg的混合溶液，作為混合對(duì)照品溶液。吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板（含4%醋酸鈉的羧甲基纖維素鈉溶液為黏合劑）上，以甲苯-乙酸乙酯-丙酮-甲醇（10∶5∶5∶0.6）為展開(kāi)劑，15℃展開(kāi)，取出，晾干，醋酐蒸汽中熏10 min，于140℃加熱30 min，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與混合對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無(wú)干擾。銀杏葉的TLC見(jiàn)圖3。

圖1 丹參的TLC1.供試品；2.陰性對(duì)照；3.丹參酮ⅡA對(duì)照品Fig 1 TLC of S.Miltiorrhiza1.samples；2.negative sample；3.tanshinone reference substance

圖2 三七的TLC1.供試品；2.陰性對(duì)照；3.混合對(duì)照品Fig 2 TLC of P.notoginseng1.samples；2.negative sample；3.mixture control

圖3 銀杏葉的TLC1.供試品；2.陰性對(duì)照；3.混合對(duì)照品Fig 3 TLC of G.biloba1.samples；2.negative sample；3.mixture control

2.2 定量分析[2]

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取丹參素鈉對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成濃度為50.0 μg·mL-1的溶液，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取樣品約0.5 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱(chēng)重，超聲處理30 min，放冷，再稱(chēng)重，用上述溶劑補(bǔ)足失重，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方比例及工藝條件制備缺丹參的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.2.4 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Nova-pak ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.5%磷酸二氫鉀溶液（0.1%磷酸溶液調(diào)pH至4.0，15∶85）；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；進(jìn)樣量：10 μL。理論塔板數(shù)按丹參素鈉峰計(jì)算應(yīng)不低于4000。在上述色譜條件下取丹參素鈉對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10 μL進(jìn)樣，結(jié)果表明樣品中其它成分對(duì)丹參素鈉的測(cè)定無(wú)干擾。色譜見(jiàn)圖4。

圖4 高效液相色譜圖A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照；1.丹參素鈉Fig 4 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.sample；C.negative control；1.sodium danshensu

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備 精密稱(chēng)取丹參素鈉對(duì)照品5.0 mg，置25 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度。精密吸取上述溶液0.5、1、1.5、2、3、5 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻。按上述色譜條件取10 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖。以檢測(cè)濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程為Y＝12.126X－17.329（r＝0.9996）。結(jié)果表明，丹參素鈉檢測(cè)濃度在10.0～100.0 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液，按照上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積。結(jié)果，RSD＝0.88%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同批次樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，測(cè)定并計(jì)算其含量。結(jié)果，丹參素鈉平均含量為每粒2.06 mg，RSD＝2.05%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，于室溫下放置，在不同時(shí)間段（0、2、4、8、16、24、48 h）按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，RSD＝1.95%，表明供試品溶液在48 h穩(wěn)定性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含量的樣品約0.5 g（含丹參素鈉為每粒1.98 mg）6份，分別精密加入不同質(zhì)量的丹參素鈉對(duì)照品，每個(gè)質(zhì)量平行2份，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定并計(jì)算其含量和加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

2.2.10 樣品含量測(cè)定 取5批樣品，分別按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定并計(jì)算其含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Content determination of samples（n＝3）

3 討論

試驗(yàn)中考察了冷浸、超聲及加熱回流3種提取方法，結(jié)果表明，冷浸48 h提取含量最高，超聲法次之，加熱回流提取含量最少。但超聲法耗時(shí)短、方法簡(jiǎn)便且雜質(zhì)較少，故本試驗(yàn)選擇此提取方法。

本試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[4～6]的流動(dòng)相：甲醇-1%冰醋酸（15∶85）、甲醇-水-冰醋酸（3∶96∶1）及甲醇-0.5%冰醋酸梯度洗脫[6]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以甲醇-0.5%磷酸二氫鉀溶液（0.1%磷酸溶液調(diào)pH值至4.0，15∶85）為流動(dòng)相時(shí)，丹參素鈉與其它組分即能達(dá)到較好分離，且柱效高、耗時(shí)短。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：52.

[2]李紅磊.丹參酮復(fù)合丹酚酸復(fù)合微乳的制備[C].南方醫(yī)科大學(xué)畢業(yè)論文集，2006：29.

[3]崔淑云，王登旭.益肝康口服液的制備及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國(guó)藥房，2008，19（3）：192.

[4]侯利強(qiáng)，邢俊生，高亞強(qiáng)，等.高效液相色譜法測(cè)定甲亢靈顆粒中丹參素的含量[J].中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2008，2（3）：8.

[5]鄒藹珍.樂(lè)脈顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國(guó)藥房，2005，16（15）：1178.