耐高溫、高濃度酒精酵母的選育與耐受性能初步鑒定

彭源德，朱作華，唐守偉，嚴 理，溫 嵐，湯清明，熊和平

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南 長沙 410205）

石油作為國民經(jīng)濟發(fā)展的戰(zhàn)略物資在經(jīng)過人類近二百年的開采后，面臨全球枯竭的局面。特別是近年來，隨著經(jīng)濟的持續(xù)增長和石油需求迅速膨脹，我國已成為繼美國之后的第二大能源消費國。針對我國人多地少、糧食緊缺和石油短缺的國情，依據(jù)不與人爭糧、不與糧爭地，能源原料多元化，實現(xiàn)持續(xù)發(fā)展的原則，開發(fā)非糧燃料乙醇生物能源，降低生產(chǎn)成本，提高轉(zhuǎn)化效率，確?，F(xiàn)代社會發(fā)展的需求，已成為國家新能源戰(zhàn)略發(fā)展最緊迫的任務(wù)。傳統(tǒng)釀酒酵母的酒精發(fā)酵最適溫度不高，一般為25℃-30℃；耐酒性較差，耐酒精濃度在10%左右。一方面，在雜菌污染嚴重的情況下，生產(chǎn)上不僅要求無菌條件嚴格，操作難度較大，而且為了控制因發(fā)酵熱所引起的溫度上升，需要加入大量冷卻水（甚至在部分氣溫較高地區(qū)，因發(fā)酵過程中過熱，根本無法進行正常生產(chǎn)），導(dǎo)致乙醇生產(chǎn)成本增加[1-4]；另一方面，酵母的耐酒精度較低，產(chǎn)物的抑制作用降低乙醇酵母的產(chǎn)乙醇潛力。因此，耐受性酒精酵母的選育研究已成為國內(nèi)外酒精行業(yè)的研究熱點[5-8]。從自然界中直接分離篩選耐高溫酒精酵母是育種工作中最經(jīng)濟適用的方法，國內(nèi)外不乏成功的例子[9-11]。

本研究擬采用自然分離篩選與紫外誘變育種相結(jié)合的方法，獲得耐高溫、耐高濃度乙醇酵母菌，達到提高乙醇產(chǎn)率、減少燃料乙醇生產(chǎn)下游工程能耗和降低成本的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌樣

菌樣采自湖南、廣東、廣西和云南等四省（區(qū)）的12縣（市），包括原始森林中的腐爛樹葉、劍麻土、甘蔗渣、酒醪、塘泥、污水、稍微腐爛的水果和蔬菜等；對照菌株（CK）為市售的丹寶利高溫活性干酵母。

1.1.2 試劑和工藝輔料

主要化學(xué)試劑有：無水葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、瓊脂、TTC（三苯基四氮唑鹽酸鹽）、氫氧化鈉溶液、鹽酸和硫酸等，這些物質(zhì)均為市售商品。

1.1.3 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：YPD液體培養(yǎng)基（1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖），自然pH；種子培養(yǎng)液：YPD液體培養(yǎng)基；平板分離培養(yǎng)基：YPD瓊脂、PDA；初篩培養(yǎng)基：TTC上層培養(yǎng)基，TTC 0.05g、葡萄糖0.5g、瓊脂0.5g、加入100mL無菌水；TTC下層培養(yǎng)基，YPD瓊脂；發(fā)酵培養(yǎng)基（YFM）：150g/L的葡萄糖，0.5%酵母膏，pH值5.0；斜面保藏培養(yǎng)基：YPD瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

稱取固體菌樣30g左右，加入300mL無菌水中，120r/min搖10min，兩層紗布過濾，收集濾液備用；液體菌樣不處理，直接用于富集培養(yǎng)。

1.2.2 富集培養(yǎng)

取菌液10ml加入盛有富集培養(yǎng)基的錐形三角瓶中，添加適量的青霉素0.1‰-0.5‰抑制細菌的生長，于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d，再取1ml進行同條件傳代培養(yǎng)，每2d接種繼代1次，3次繼代后進行分離純化。

1.2.3 分離純化

將稀釋的富集培養(yǎng)液，涂布于分離培養(yǎng)基平板上，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d，挑取典型酵母菌落至YPD瓊脂斜面，編號、培養(yǎng)，性能鑒定后將酵母菌劃線分純、保藏。

1.2.4 酵母菌的初篩

利用產(chǎn)酒精能力強的酵母菌能還原三苯基四氮唑鹽酸鹽（TTC）變?yōu)樯罴t色這一特性，篩選深紅色菌落。將分離得到的各菌株依次接入TTC下層培養(yǎng)基的平皿中，培養(yǎng)24h，長出菌落后倒入TTC上層培養(yǎng)基，30℃下保溫（陰暗處）2-3 h。比較各菌株之間的產(chǎn)酒精能力，初篩出產(chǎn)酒精能力強的酵母菌株，將酵母菌接種于YPD瓊脂斜面培養(yǎng)基中，低溫保藏。

1.2.5 酵母菌的復(fù)篩

將斜面菌種接一環(huán)于新鮮的種子培養(yǎng)液中，于30℃，170r/min搖床培養(yǎng)24h。按10%接種量將菌種接入裝有100ml發(fā)酵培養(yǎng)基（YFM）的三角瓶中，于35℃培養(yǎng)箱，靜置發(fā)酵72h后測產(chǎn)氣情況和酒精含量。

1.2.6 誘變育種

以復(fù)篩后的酵母菌為始發(fā)菌，接種于種子培養(yǎng)液培養(yǎng)12h后，通過高溫（45℃）處理20min、調(diào)整菌懸液濃度為106個/ml，取5ml于無菌平皿中，進行紫外線處理（照射功率15w、照射距離20cm、照射時間10min、殺傷率在99.99%以上），然后對菌液進行分離、富培、純化和菌株表型特征觀察，菌體進行鏡檢。同時，對始發(fā)菌和誘變菌株進行乙醇發(fā)酵試驗，發(fā)酵液起始葡萄糖濃度200g/L。

1.2.7 耐受性試驗

一般采用500ml錐形瓶盛培養(yǎng)液200ml，起始糖度為150g/l，接種量5%，自然pH，置35℃恒溫靜止培養(yǎng)72h，以丹寶利耐高溫活性干酵母作對照，3次重復(fù)。根據(jù)研究目的設(shè)置的特定條件有：

①耐熱性：分別在30℃、35℃、40℃和45℃條件下發(fā)酵72h，測定發(fā)酵液的酒精濃度。

②耐乙醇能力：分別設(shè)置種子液的乙醇起始濃度為0%、4%、8%、12%、16%和20%，于35℃恒溫培養(yǎng)24h，觀察菌種生長，在660nm下測定培養(yǎng)液消光值（OD）。

③耐糖能力：分別設(shè)置發(fā)酵液糖的起始濃度為150g/l、200g/l、250g/l和300g/l，發(fā)酵72h，測定發(fā)酵液的酒精濃度。

1.2.8 測定方法

酒精濃度采用酒精比重計法測定[12]。

2 結(jié)果與討論

2.1 酒精酵母菌的篩選

酒精酵母菌的分離與篩選結(jié)果列于表1，從表中看出，采集的22個菌樣中共分離出98個菌株，經(jīng)初篩，獲得12株酵母菌，占分離菌株的15.3%；酵母菌廣泛分布于4省（市）12個縣（市）的8類菌樣中；經(jīng)復(fù)篩，獲得4株（編號分別為：S11、S12、S15、S17）耐高溫的酒精酵母菌株，它們分別來自腐爛樹葉、甘蔗渣、劍麻土和酒醪等菌樣。

從不同溫度下酵母菌的生長情況表2和表3可以看出，復(fù)篩出的4株酵母菌株均能在40℃下較好的生長，耐熱性能與對照菌株丹寶利耐高溫活性干酵母相當(dāng)。

表1 酵母菌的分離與篩選結(jié)果Tab.1 Isolation and screeningofthermotolerant yeasts

表2 不同溫度下菌落的生長情況Tab.2 Growth ofyeasts under different temperatures

表3 不同溫度下酵母菌的吸光值Tab.3 ODvalues ofyeasts under different temperatures

2.2 耐受性酵母菌的誘變育種

為了進一步提高優(yōu)良菌株S15和S17發(fā)酵能力，對它們分別進行了高溫處理和紫外線誘變育種試驗，酵母菌誘變育種結(jié)果表4表明，高溫和紫外線處理對該2株菌的產(chǎn)酒精能力均有不同程度的提高；并獲得了1株產(chǎn)酒精能力比CK高12.6%的酵母菌株，編號為S132。

表4 耐受性酵母菌誘變育種結(jié)果Tab.4 Ethanol tolerance comparison before and after mutant treatment

2.3 菌落和菌體特征

酵母菌在YPD瓊脂平板及種子培養(yǎng)液中生長特征如表5。表中結(jié)果顯示，酵母菌的菌落較濕潤，表面光滑，容易挑取，菌落質(zhì)地均勻，中間凸起，正反面以及邊緣與中間的顏色較一致，菌落顏色比較單調(diào)，乳白色；液體培養(yǎng)基中均表現(xiàn)為底部生長，不形成膜或環(huán)；誘變處理獲得的菌株S132的菌落形態(tài)和菌體特征見圖1和圖2，具酵母菌的典型特征，其屬和種名有待于進一步鑒定。

表5 酵母菌的菌落形態(tài)特征Tab.5 Colonycharacteristics ofthermotolerant yeasts

圖1 S132的菌落形態(tài)Fig.1 Colonycharacteristic ofyeast S132

圖2 S132的菌體特征Fig.2 Cytomorphological characteristic ofyeast S132

2.4 耐受性初步鑒定

2.4.1 耐高溫試驗

表6列出了不同發(fā)酵溫度對酵母菌發(fā)酵性能的影響結(jié)果，由表6看出，3株菌株在30℃和36℃均具有良好的發(fā)酵性能；S132和S15在40℃仍具有一定的發(fā)酵活性，與CK相比，發(fā)酵液乙醇濃度分別提高20.9%和14%，說明是很有潛力的耐高溫酵母菌株。

表6 發(fā)酵溫度對酵母菌發(fā)酵性能的影響Tab.6 Influence oftemperature on fermentation abilityofyeasts

2.4.2 耐乙醇試驗

酵母菌在乙醇含量0-20%的YPD培養(yǎng)基中的生長情況見表7，從表中看出，四株酵母菌隨著培養(yǎng)基乙醇濃度的增加，菌數(shù)不斷減少，表明高濃度的乙醇含量會抑制酵母的生長繁殖。但S132對乙醇的耐受性大于對照，當(dāng)培養(yǎng)基中乙醇含量為16%時，耐乙醇能力比對照高15%。

表7 不同乙醇濃度培養(yǎng)的酵母菌液消光值Tab.7 ODvalues ofyeasts fermented under different ethanol concentrations

2.4.3 耐糖性試驗

酵母菌耐糖性試驗結(jié)果如表8。由表8看出，S132和S15的耐糖性能與對照相當(dāng)，發(fā)酵液糖濃度由150g/L提高到200g/L時，乙醇濃度大幅度增加；糖濃度在200g/L至300g/L時，乙醇濃度變化不大。

表8 發(fā)酵液起始糖濃度對酵母菌發(fā)酵性能的影響Tab.8 The effect ofstartingconcentration ofglucose on fermentation abilityofyeasts

3 結(jié) 論

采取自然分離篩選與誘變育種相結(jié)合的方法，是選育高耐受性酒精酵母經(jīng)濟適用的方法之一。通過本研究可以得出以下結(jié)論：①經(jīng)富集培養(yǎng)，初篩、復(fù)篩，從22個菌樣中共分離獲得4株（編號分別為：S11、S12、S15、S17）耐高溫的酒精酵母菌株，它們分別來自腐爛樹葉、甘蔗渣、劍麻土和酒醪等菌樣；②對S15、S17進行誘變育種，獲得1株編號為S132的耐受性優(yōu)良酒精酵母；③選育獲得酵母菌的菌落較濕潤，表面光滑，容易挑取，菌落質(zhì)地均勻，中間凸起，正反面以及邊緣與中間的顏色較一致，菌落顏色比較單調(diào)，乳白色；液體培養(yǎng)基中均表現(xiàn)為底部生長，不形成膜或環(huán)，具酵母菌的典型特征；④與對照丹寶利耐高溫酵母相比，S132耐受40℃高溫和乙醇的能力分別高出20.9%和15%，是一株良好的高耐受性酒精酵母。

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