纖維燃料乙醇生產(chǎn)中木糖發(fā)酵的研究進(jìn)展

曹秀華，阮奇城，林海紅，胡開輝，孫淑靜，祁建民

（福建農(nóng)林大學(xué)教育部作物遺傳育種與綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002）

農(nóng)作物秸稈是一種具有多用途的可再生生物資源，也是地球上最豐富的有機(jī)物質(zhì)之一。我國是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)作物秸稈數(shù)量大、種類多、分布廣，長期以來則作為主要燃料或廢棄、焚燒。嚴(yán)重污染了大氣環(huán)境，制約了農(nóng)村經(jīng)濟(jì)可持續(xù)性發(fā)展。能源危機(jī)已迫在眉睫，開發(fā)可再生能源已成為我國必須面對的重要課題。以淀粉類和糖類為原料生產(chǎn)燃料乙醇，考慮到糧食安全，已被叫停。以農(nóng)作物纖維素類生產(chǎn)燃料乙醇，適應(yīng)我國國情發(fā)展方向。目前，國際上纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)化仍存在三大技術(shù)瓶頸，一是將木質(zhì)纖維素類原料降解產(chǎn)生的木糖轉(zhuǎn)化成乙醇較難，二是纖維素酶生產(chǎn)成本仍然偏高，三是原料要進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理。木糖是木質(zhì)纖維原料水解產(chǎn)物中含量僅次于葡萄糖的一種單糖，可達(dá)植物纖維原料水解糖液的30%[1]，但木糖等五碳糖不能由傳統(tǒng)釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)生乙醇。因此，篩選到能利用木糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇的高效菌株，在木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化燃料酒精的研究中具有重大意義。

1 木糖發(fā)酵菌種，包括天然菌種和基因工程菌株

目前在自然界中篩選到的能將木糖轉(zhuǎn)化成乙醇的微生物主要有：細(xì)菌、絲狀真菌和酵母菌。代謝木糖產(chǎn)生乙醇的細(xì)菌種類很多，除了能發(fā)酵單糖外還能發(fā)酵纖維素、生物高聚糖等，但細(xì)菌在發(fā)酵中會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物且乙醇得率低，易染雜菌等。Lynda等發(fā)現(xiàn)一株極端嗜熱的產(chǎn)乙醇細(xì)菌（Thermoanerobacter ethanolicus）可在 68℃高溫下采用連續(xù)培養(yǎng)法轉(zhuǎn)化木糖獲得乙醇，其得率可達(dá)0.144g/g。絲狀真菌中能利用木糖產(chǎn)乙醇的菌種較少，相關(guān)研究不多。有粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）和尖鐮孢菌（Fusarium oxysporum）等。絲狀真菌能產(chǎn)半纖維素酶和纖維素酶，適于植物纖維原料的同步糖化發(fā)酵。與細(xì)菌的乙醇發(fā)酵相比，酵母菌具有酒精轉(zhuǎn)化率高、得率高、酒精耐受能力高、副產(chǎn)物少、發(fā)酵過程不易污染等優(yōu)點(diǎn)。酵母菌中可發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇的菌有：嗜鞣管囊酵母（Pachysolen tannophilus）、休哈塔假絲酵母（Candida shehatae）、樹干畢赤酵母（Pichia stipitis）、季也蒙畢赤酵母（Pichia guilliermondii）、酒香酵母（Bret tanomyces anomalus）和產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）等[2]。宋安東等曾用嗜鞣管囊酵母（Pachysolen tannophilus）對木糖和葡萄糖混合液共發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇，發(fā)酵過程中糖利用率較高，發(fā)酵過程中先利用葡萄糖，在葡萄糖利用完后再利用木糖。菌體生長和乙醇產(chǎn)生隨發(fā)酵時(shí)間延長而改變，發(fā)酵醪液中乙醇濃度為2%[3]。近年來許多研究者構(gòu)建了可以同時(shí)高效代謝五碳糖和六碳糖的基因重組菌，對纖維質(zhì)乙醇發(fā)酵的轉(zhuǎn)化率有很大提高。

2 木糖發(fā)酵乙醇機(jī)理

將木糖轉(zhuǎn)化成乙醇的細(xì)菌、絲狀真菌和酵母菌的木糖代謝途徑是不同的。大多數(shù)細(xì)菌（如E.coli和Bacillus等）首先在木糖異構(gòu)酶作用下，將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖，然后在木酮糖激酶的作用下磷酸化成磷酸木酮糖，繼而進(jìn)入磷酸戊糖循環(huán)（ppp途徑）代謝，ED途徑與ppp途徑耦聯(lián)，ED途徑產(chǎn)生乙醇[4]。

利用木糖的酵母和絲狀真菌的木糖代謝途徑，首先是在依賴NADPH的木糖還原酶（XR）的作用下將木糖還原成木糖醇，然后在依賴NAD+的木糖醇脫氫酶（XDH）作用下氧化形成木酮糖，再經(jīng)木酮糖激酶磷酸化形成5-磷酸木酮糖，進(jìn)入磷酸戊糖途徑（PPP）。PPP途徑的中間產(chǎn)物6-磷酸葡萄糖及3-磷酸甘油醛通過酵解途徑形成丙酮酸。丙酮酸或是經(jīng)丙酮酸脫羧酶、乙醇脫氫酶還原為乙醇；或在好氧條件下，通過TCA循環(huán)及呼吸鏈徹底氧化成CO2[5]。酵母的木糖發(fā)酵在兼性厭氧條件下進(jìn)行，其總反應(yīng)式為：

所以，木糖乙醇發(fā)酵乙醇的最高理論產(chǎn)率為0.46g酒精/g葡萄糖。低于葡萄糖酒精發(fā)酵的理論得率0.51g酒精/g葡萄糖。

3 木糖發(fā)酵菌的基因工程改良

能進(jìn)行木糖乙醇發(fā)酵的天然菌種很少，通過基因工程技術(shù)獲得新的菌種可提高木糖乙醇發(fā)酵能力，宿主菌株主要集中在大腸桿菌（E.coli）、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌（Z.mobilis）和釀酒酵母（S.cerevisiae）上。

3.1 木糖發(fā)酵重組細(xì)菌的構(gòu)建

大腸桿菌（E.coli）含有利用木糖的所有必需酶，但厭氧條件下發(fā)酵形成的產(chǎn)物很復(fù)雜，包括乳酸、乙酸、琥珀酸和甲酸等，乙醇只是其中很少的一部分。生成乙醇的最后階段是由丙酮酸脫羧酶（pdc）和乙醇脫氫酶（adh）催化進(jìn)行的，E.coli缺少pdc，且adh水平低。KO11即是E.coli的基因重組菌株，能過量表達(dá)來自Z.mobilis的丙酮酸脫羧酶基因pdc和乙醇脫氫酶基因adhB，從而能高效地將葡萄糖和木糖發(fā)酵為乙醇，乙醇產(chǎn)率為理論值的85%-92%[6]。孫金鳳等從Z.mobilis的DNA中擴(kuò)增出pdc、adhB，分別用lac啟動(dòng)子控制表達(dá)，構(gòu)建了可以在E.coli JM109中表達(dá)的重組質(zhì)粒pKK-PA、pEtac-PA，得到的重組菌幾乎專一的發(fā)酵產(chǎn)生乙醇[7]。楊秀山等構(gòu)建的大腸桿菌E.coli（pGM-PA）使乙醇產(chǎn)量有了明顯的提高，固定化E.coli（pGM-PA）發(fā)酵混合糖的乙醇產(chǎn)率達(dá)到理論值的85%，木糖利用率達(dá)到80%，混合糖利用率達(dá)83%[4]。

Zhang等利用基因克隆在Z.mobilis中構(gòu)建了能產(chǎn)生木糖異構(gòu)酶（xylA）、木酮糖激酶（xylB）、轉(zhuǎn)酮酶（tktA）、轉(zhuǎn)醛酶（tal）的菌株。獲得的重組菌Z.mobilis CP4（pZB5）可以五碳糖為碳源，乙醇產(chǎn)量可達(dá)理論產(chǎn)率的86%；在含木糖和葡萄糖各為25 g/L的混合碳源中培養(yǎng)，兩種糖的乙醇產(chǎn)率均達(dá)到理論值的95%[8]。Mohagheghi等將發(fā)酵木糖和阿拉伯糖所需的7個(gè)基因整合到Z.mobilis染色體上的特異位點(diǎn)——乳酸脫氫酶基因（ldh）中，獲得了一株穩(wěn)定的整合重組菌株AX101，在賦予新菌株發(fā)酵利用木糖和阿拉伯糖能力的同時(shí)，也減少了副產(chǎn)物乳酸的生成[9]。但重組菌株由于引入的基因存在于質(zhì)粒上，穩(wěn)定性較差，經(jīng)連續(xù)發(fā)酵后質(zhì)粒容易丟失而使發(fā)酵能力下降，并且對乙醇及纖維原料水解液中的抑制物耐受性差。

3.2 酵母菌的木糖代謝工程改造

釀酒酵母（S.cerevisiae）是傳統(tǒng)的酒精生產(chǎn)菌株，具備良好的工業(yè)生產(chǎn)性狀，其全序列已測定，遺傳操作技術(shù)也已經(jīng)成熟[10]。雖然釀酒酵母不能直接利用木糖，卻具備木酮糖代謝的完整酶系[11]。不過，酒精代謝屬于初級代謝，大多數(shù)微生物分享大量共同代謝途徑，因此擴(kuò)大釀酒酵母的底物范圍，提高其對木糖的利用只需添加少數(shù)幾個(gè)酶反應(yīng)步驟即可。通常，微生物經(jīng)2條獨(dú)立路線將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖，一是在木糖還原酶和木糖醇脫氫酶的共同作用下分2步反應(yīng)完成，常存在于酵母中；二是通過木糖異構(gòu)酶直接轉(zhuǎn)化為木酮糖，該反應(yīng)在細(xì)菌中很典型[12]。通過途徑工程理念，改造釀酒酵母代謝途徑，使其具有共發(fā)酵葡萄糖和木糖產(chǎn)生酒精的能力，以此提高酒精轉(zhuǎn)化率[13]。

早在1990年，Kotter等將樹干畢赤氏酵母的木糖還原酶基因（XYL1）與木糖醇脫氫酶基因（XYL2）克隆到釀酒酵母中。重組酵母能在木糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長，但不能發(fā)酵木糖產(chǎn)生乙醇，所利用的木糖全部被氧化[14]。

但研究發(fā)現(xiàn)，XYL1與XYL2相對表達(dá)水平的變化影響乙醇轉(zhuǎn)化率；XYL2表達(dá)量的進(jìn)一步提高，會(huì)導(dǎo)致木酮糖的累積分泌。木酮糖激酶催化木酮糖磷酸化形成5-磷酸木酮糖成為木糖代謝的限速步驟之一[15]。木酮糖激酶是木糖代謝途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，釀酒酵母自身的表達(dá)活性很低。如果過量表達(dá)木酮糖激酶，對木酮糖無限制的磷酸化催化在某種程度上會(huì)耗盡胞內(nèi)ATP，從而引起細(xì)胞生長的毒害[16]。因此，木酮糖激酶的表達(dá)必須維持較適宜的水平。最近，Karhumaa等對嗜熱細(xì)菌Thermus thermophilus的XI基因、XK基因及眾多非氧化磷酸化途徑酶基因的酵母菌株進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)釀酒酵母對木糖的有效利用不僅依賴于從木糖到木酮糖的有效轉(zhuǎn)化，也依賴于非氧化磷酸化途徑對木酮糖的進(jìn)一步有效代謝[17]。轉(zhuǎn)酮酶（Transketolase，Tkl1）和轉(zhuǎn)醛酶（Transaldolase，Tal1）是PPP途徑中的關(guān)鍵酶，影響重組菌發(fā)酵木糖產(chǎn)生乙醇的能力，但釀酒酵母的這兩種酶酶活都較低。鮑曉明等[18]以E.coli-S.cerevisiae穿梭質(zhì)粒YEp24為骨架，將Pichia stipitis CBS6054的xyl1及xyl2分別放在釀酒酵母的乙醇脫氫酶Ⅰ（ADH1）啟動(dòng)子和磷酸甘油激酶（PGK）啟動(dòng)子下，構(gòu)建不同的xyl1及xyl2重組質(zhì)粒，并在重組菌株中引入Tkl1和Tal1基因，使酵母菌在原有水平的基礎(chǔ)上超表達(dá)合成轉(zhuǎn)酮酶及轉(zhuǎn)醛酶，這樣得到的重組菌株可以在木糖為唯一碳源的平板上生長。搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，xyl1/xyl2比值為0.06的菌株，木糖較少被氧化，其他副產(chǎn)物也有所下降，乙醇得率有所提高。

引入細(xì)菌木糖異構(gòu)酶基因（xylA）是使釀酒酵母轉(zhuǎn)化木糖為木酮糖的又一途徑。細(xì)菌的木糖異構(gòu)酶因不需要任何輔助因子，最初被認(rèn)為是構(gòu)建利用木糖釀酒酵母代謝工程菌株的便利途徑。早期多個(gè)研究將多種來源如E.coli、Bacillus subtilis、Actinoplanes missouriensis等的木糖異構(gòu)酶基因克隆轉(zhuǎn)化到釀酒酵母中，甚至已從重組酵母中得到外源xylA基因正確大小的蛋白產(chǎn)物，但均沒有得到活性表達(dá)[19]，其可能原因是細(xì)菌和酵母最適pH不同，酶折疊不正確，或者后期翻譯模式不合適[20]。直到1996年，Walfridsson等將古細(xì)菌嗜熱細(xì)菌（Thermus thermophilus）的木糖異構(gòu)酶基因（xylA）轉(zhuǎn)入釀酒酵母，首次在釀酒酵母突變株XI中得到了活性表達(dá)[21]。Lonn等用易錯(cuò)PCR方法對T.thermophilus的xylA進(jìn)行定向改造，以此解決其最適反應(yīng)溫度過高的問題，但效果仍不理想。突變株XI最適反應(yīng)溫度降至60℃，但其熱穩(wěn)定性卻大大降低[22]。鮑曉明等從Thermus thermophilus克隆得到xylA，轉(zhuǎn)化釀酒酵母，成功地在釀酒酵母中得到木糖異構(gòu)酶活性表達(dá)，同時(shí)表達(dá)xylA和超表達(dá)TKl1和TAl1的釀酒酵母重組菌可以在木糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長，經(jīng)搖瓶發(fā)酵，該菌株可以發(fā)酵木糖生產(chǎn)乙醇，產(chǎn)量為1.3 g/L[23]。

4 展 望

木質(zhì)纖維原料的主要成分為纖維素、半纖維素、木質(zhì)素，在木質(zhì)纖維原料轉(zhuǎn)化為酒精過程中，如果能高效的將木糖轉(zhuǎn)化為酒精，在理論上可提高乙醇產(chǎn)量達(dá)25%，可降低生產(chǎn)成本。由于很難在自然界中篩選到高效的木糖發(fā)酵菌，所以研究者開始致力于構(gòu)建能高效利用六碳糖和五碳糖產(chǎn)乙醇的基因重組菌。目前基因重組菌的構(gòu)建主要包括兩個(gè)方面：一是將戊糖代謝途徑引入只能代謝六碳糖產(chǎn)乙醇的菌株中；二是將高效產(chǎn)乙醇關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)入能代謝六碳糖和五碳糖但乙醇產(chǎn)量低的菌株中。目前研究表明，通過基因重組可以獲得能高效轉(zhuǎn)化六碳糖和五碳糖產(chǎn)乙醇的重組菌株。但在實(shí)際應(yīng)用中仍存在問題，主要包括：菌種底物范圍??；乙酸等抑制物耐受性低；乙醇耐受性較低；重組菌株不穩(wěn)定；發(fā)酵過程中產(chǎn)生副產(chǎn)物并影響其發(fā)酵；發(fā)酵工藝需改良優(yōu)化等。另外，所得重組菌株的應(yīng)用還限制在實(shí)驗(yàn)室范圍，還沒有應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。因此，繼續(xù)并加強(qiáng)對重組菌株構(gòu)建和木糖代謝的研究，對提高木質(zhì)纖維原料轉(zhuǎn)化乙醇有十分重要的意義。

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