適于AFLP分析的大麻干葉DNA快速提取方法研究

胡尊紅 ，陳 璇 ，郭鴻彥 ，許艷萍 ，張慶瀅 ，郭孟璧 ，伍菊仙 ，楊 明 *

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，昆明，650201；2.云南農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，昆明，650205；3.云南工業(yè)大麻股份有限公司，昆明，650217）

大麻（Cannabis sativa L.）是大麻科（Cannabinance）大麻屬（Cannabbis）一年生草本植物，多為雌雄異株，雌雄比例為1：1[1]。我國大麻種質(zhì)資料豐富，有著悠久的栽培利用歷史。其經(jīng)濟(jì)利用價值涉及紡織、建材及造紙等各個方面[2]。

擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）是由荷蘭Vos.P和Zabeau M（1995）創(chuàng)建發(fā)展的一種新的DNA分子標(biāo)記技術(shù)[3]。AFLP技術(shù)是RFLP和RAPD技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，其多態(tài)性強(qiáng)，試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好，被認(rèn)為是一種較為理想的高效分子標(biāo)記技術(shù)[4]。DNA提取是分子生物學(xué)試驗(yàn)研究的一項(xiàng)基礎(chǔ)技術(shù)，而能否提取到高質(zhì)量DNA是AFLP試驗(yàn)成功的關(guān)鍵。在以前的研究中大多數(shù)學(xué)者都是以大麻新鮮嫩葉片作為DNA提取的材料[5-9]，用新鮮嫩葉提取DNA可以滿足一般分子試驗(yàn)要求，但對于遠(yuǎn)距離采樣或不具備超低溫保存的條件下，新鮮嫩葉不宜長期保存，為了防止試驗(yàn)材料降解，特別是遠(yuǎn)距離采集珍貴野外材料，通常需對材料進(jìn)行采用變性硅膠或烘干處理保存。同時，由于大麻毒品的販賣形式常為制干的花葉部分，通過對其提取DNA進(jìn)行鑒定，可以鑒定該樣品的所屬品種，從而初步推斷出它的來源地。目前尚未有關(guān)于對大麻植物干燥花葉材料DNA提取方法研究的報道。據(jù)文獻(xiàn)報道，王婷等[10]（2008）采用改良CTAB法從變色硅膠干燥的忍冬葉片中提取的DNA質(zhì)量與鮮葉無明顯差異，完整性好，純度高而且干燥葉片產(chǎn)率更高，能被EcoR I完全酶切。郝崗平等[11]（2006）在傳統(tǒng)CTAB法基礎(chǔ)上以泰山白花丹參干葉片比較了4種DNA提取方法，獲得了一種簡便、快速分離高質(zhì)量完整DNA的方法，所得的DNA可直接用于AFLP分析，另外還有從其他植物干材料提取高質(zhì)量DNA的相關(guān)報道[12-16]。為了滿足科研和禁毒工作的實(shí)際需求，減少工作量和材料保存成本，本研究利用大麻干葉快速提取基因組DNA并進(jìn)行AFLP-PCR擴(kuò)增，其操作簡便，又節(jié)省時間和成本，具有良好的重復(fù)性，為大麻AFLP遺傳分析研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用大麻材料（Cannabis sativa L.）均由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供，避光保存時間兩年以上的大麻干葉材料為Ym8 Ym39 Ym81 Ym102 Ym265等共23份。

主要試劑：CTAB、EDTA、PVP-40、β-巰基乙醇、抗壞血酸、RNaseA酶、瓊脂糖等試劑購自昆明森格瑪公司；EcoRI、MseI、T4 ligase、Taq 酶、dNTP、MgCl2 等購自 Fermentas公司。

主要儀器：DNA擴(kuò)增儀（Bio-Rad 9700，美國），紫外凝膠成像儀（Bio-Rad UVP GDS-8000，美國），高速冷凍離心機(jī)（Hermle Labortechnlk，德國），多用電泳儀電源（DYY-12C，北京），測序電泳儀（JUNYI，北京），純水儀（Aquapro，重慶），紫外分光光度計(jì)（UV-7504，上海）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大麻干葉DNA提取

本研究在傳統(tǒng)的植物基因組提取CTAB法基礎(chǔ)上做如下4種改進(jìn)處理，目的是高效防止DNA褐化，并去除多糖、酚類化合物。

具體方法如下：

稱取約0.5g大麻干葉樣放入研缽中，并加入少量石英沙，用液氮迅速研磨成粉末，越細(xì)越好，將粉末轉(zhuǎn)至1.5mL離心管，再加入800μL 65℃預(yù)熱的CTAB提取液（2%CTAB，1.4MNaCl，100mM Tris-HCl pH 8.0，20mMEDTA pH 8.0，各處理組分），65℃水浴1h，每隔10分鐘搖動一次；4℃12000rpm下離心15min，取上清液加入等體積苯酚-氯仿-異戊醇（25：24：1）顛倒充分混勻，靜置約5min；4℃12000rpm下離心10min，取上清液加入等體積氯仿-異戊醇（24：1），輕搖混勻，靜置3-5min；4℃12000rpm下離心10min，取上清液加入2/3體積的冰凍異丙醇（-20℃），輕搖混勻，-20℃下沉淀DNA30-60 min；4℃10000rpm下離心10min，棄上清液（或用槍頭挑起沉淀），用預(yù)冷的70%乙醇浸洗沉淀2次，每次30min，離心后在超凈工作臺上充分風(fēng)干，加入200μL 1xTE（pH8.0）溶解 DNA。

1.2.2 大麻干葉DNA純化

溶解好的基因組DNA，加入2μL10mg/mLRNase，37℃水浴1h，消化RNA；再加入等體積的氯仿-異戊醇（24：1），輕搖混勻后，12000rpm下離心10min；取上清液，加入1/10倍體積的3MNaAc（PH 5.4）及預(yù)冷的2倍體積無水乙醇，輕搖混勻后，-20℃靜置約30min，沉淀DNA；用預(yù)冷的70%乙醇浸洗沉淀2次，無水乙醇浸洗1次，每次20min，離心后在超凈工作臺上充分風(fēng)干，加100μL 1xTE（pH8.0）溶解。取適量DNA測定其濃度和純度，其余樣品在-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 DNA純度、濃度檢測

（1）紫外吸收檢測：

四個方法提取的DNA樣品各取2μL，用ddH2O稀釋50倍，用ddH2O為空白對照，在紫外分分光光度計(jì)上測定OD260、OD280值及OD260/OD280的比值，并用OD260／OD280比值估算DNA的純度，DNA濃度（ug/mL）=OD260×50×稀釋倍數(shù)。

（2）瓊脂糖凝膠電泳檢測：

取5μLDNA樣品在O.8%瓊脂糖凝膠上電泳（0.5×TBE），QuantityOne凝膠成像儀觀察并照相，比較不同方法提取大麻干葉的DNA的帶型，并通過和λDNA的亮度對比來估計(jì)基因組DNA濃度。

1.2.4 AFLP-PCR擴(kuò)增及聚丙烯酰胺凝膠電泳

參照Vos等[3]（1995）的方法，略有改動。

首先在37下用限制性內(nèi)切酶EcoRI和MseI對DNA進(jìn)行雙酶切，經(jīng)檢測完全酶切的產(chǎn)物加入T4連接酶在16-22℃過夜連接；連接產(chǎn)物稀釋10倍后進(jìn)行PCR預(yù)擴(kuò)增，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20倍進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后用銀染法檢測。

2 .結(jié)果與分析

2.1 大麻干葉DNA提取方法比較

DNA的質(zhì)量是AFLP成功與否的關(guān)鍵，通過對常用的3個抗氧化劑：巰基乙醇、PVP及抗壞血酸進(jìn)行組合形成了四個處理，利用這四個處理提取同一批大麻干葉DNA，并進(jìn)行瓊脂糖電泳（圖1）?？梢钥闯?，METHOD3處理提取的DNA電泳條帶清晰不拖尾，無蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)殘留膠孔，說明其完整性好、純度較高。METHOD1處理提取的DNA條帶淡，膠孔發(fā)亮，說明DNA產(chǎn)率低，還殘留蛋白質(zhì)及多糖等雜質(zhì)；METHOD2處理?xiàng)l帶清晰但暗淡，說明完整性好但產(chǎn)率太低。METHOD4處理和METHOD3處理效果類似，提取的DNA條帶清晰，無明顯降解，但METHOD4處理點(diǎn)樣孔有雜質(zhì)滯留，說明在METHOD3處理的基礎(chǔ)上添加100mmol/L抗壞血酸反而不能很好去除蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)。四個處理提取的DNA在紫外分光光度計(jì)上測定其純度及濃度（表1），同樣說明了用METHOD3處理來提取大麻基因組DNA效果最佳。鑒于以上結(jié)果，采用METHOD3處理提取了五個大麻品種干葉DNA（圖2），呈現(xiàn)出DNA條帶清晰無拖尾，完整性好，純度高等特點(diǎn)。

2.2 AFLP分析

將METHOD3處理提取到的大麻DNA樣品經(jīng)酶切、連接、預(yù)擴(kuò)增及選擇性擴(kuò)增后，用6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染法檢測并拍照。

DNA能否充分酶切是AFLP指紋圖譜真實(shí)與否的關(guān)鍵，不完全酶切的產(chǎn)物會導(dǎo)致后期擴(kuò)增帶型不穩(wěn)定，不能充分反映擴(kuò)增DNA片段真實(shí)的多態(tài)性，而高質(zhì)量的DNA又是高效酶切的前提和保證。把METHOD3處理提取得到的DNA經(jīng)EcoR I/Mse I雙酶切，并進(jìn)行1.2%瓊脂糖電泳（圖3）。電泳檢測結(jié)果可知，酶切后的DNA片段呈彌散（smear）狀，看不見大分子的DNA，且片段小于1000bp，多集中在500bp以下，說明基因組DNA已被EcoR I/Mse I完全酶切，可以用來進(jìn)行AFLP的后續(xù)工作。

圖1 不同處理方法提取的大麻干葉基因組DNA的瓊脂糖電泳圖譜Figure 1．The pattern ofgenomic DNAextracted fromdried hemp leaves bydifferent methods

表1 不同處理方法提取的大麻DNA樣品純度及濃度檢測Table 1 DNApurityand yield detected byUV-Spectrometer

圖2 METHOD3處理提取不同大麻干葉基因組DNA電泳圖譜Figure 2.The pattern ofgenomic DNAfromdifferent dried hemp leaves byMETHOD3

圖3 METHOD3法提取DNA的酶切鑒定Figure 3.Enzyme digestion identification of genomic DNA extracted byMETHOD3

圖4 預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜Figure 4.Electrophoretic pattern ofpre-amplification

圖5 選擇性擴(kuò)增聚炳烯酰胺圖譜Figure 5.Electrophoretic pattern ofselective amplification

AFLP擴(kuò)增體系包括預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增兩個環(huán)節(jié)，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量直接關(guān)系下一步的選擴(kuò)。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測（圖4），擴(kuò)增片段小于1000bp，且多集中在500bp以下，條帶亮，符合預(yù)擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)。在AFLP選擇性擴(kuò)增中，使用E33/M49引物組合進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)變性后在6%的變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，銀染、顯色后條帶清晰、多態(tài)性豐富（圖5）

3 討 論

DNA質(zhì)量是AFLP成功的關(guān)鍵，其中影響AFLP主要的物質(zhì)是酚類物質(zhì)、多糖、單寧等，這些物質(zhì)的存在不僅影響酶切的效果而且還影響后續(xù)PCR反應(yīng)中Polymerase的活性[10，11]。在不同植物材料或相同材料不同部位中這些物質(zhì)的含量都不一樣，大麻花葉中含這化合物較多，尤其是酚類化合物，目前報道的已有61種[1]，酚類物質(zhì)在DNA提取過程中極易被氧化，而使提取的大麻DNA呈黃色或褐色，而且含有雜質(zhì)。針對這種情況，本試驗(yàn)在傳統(tǒng)CTAB法上進(jìn)行了改良，添加不同的抗酚類氧化褐變物質(zhì)，以篩選出適宜AFLP分析的大麻基因組DNA提取的有效方法。本試驗(yàn)證明，在CTAB提取液中添加了2%β-巰基乙醇（V/V）和3%PVP-40（V/V），能夠有效的防止酚類化合物的氧化，同時DNA得率也較高。β-巰基乙醇作為還原劑，可以防止酚類物質(zhì)的氧化；PVP作為螯合劑能夠結(jié)合多酚化合物，增加DNA提取物的溶解性，并在離心過程中可被直接除去。在試驗(yàn)過程中METHOD1和METHOD2中都加有抗壞血酸，然而提取的DNA質(zhì)量和濃度并不理想，甚至還有雜質(zhì)殘留；另外，用METHOD4處理（基本提取液+2%β-巰基乙醇（V/V）+3%PVP-40（M/V）+100mmol/L抗壞血酸）提取的DNA雖然有著較高的得率，但是仍然有蛋白質(zhì)及多糖等雜質(zhì)殘留膠孔，究其原因可能是由于抗壞血酸的加入改變了提取液中離子條件，又或者是其本身和其它物質(zhì)相互作用而導(dǎo)致提取液在離心過程中去除蛋白、多糖的能力下降。

DNA提取固然重要，但是DNA的純化也直接影響著DNA的質(zhì)量，本試驗(yàn)在添加RNase消化RNA后，加入等體積的氯仿-異戊醇（24：1）來去除溶液中殘留的蛋白質(zhì)，離心后加入1/10倍體積的3MNaAc（PH 5.4）及預(yù)冷的2倍體積無水乙醇來沉淀基因組DNA，這樣就保證了溶液中多糖、金屬離子及其它雜質(zhì)被乙醇充分溶解，從而保證了DNA的純度。

完全酶切是AFLP成功基礎(chǔ)，也是保證試驗(yàn)結(jié)果可靠的前提，在該步驟中本試驗(yàn)采取了分次加限制性內(nèi)切酶的方法，這樣就保證了酶的活性，讓基因組DNA在最短的時間內(nèi)得到了充分的酶切。

4 結(jié) 論

本研究對如何從大麻干葉中提取高質(zhì)量的適合AFLP試驗(yàn)的基因組DNA進(jìn)行了探討，結(jié)果表明，在CTAB提取液中添加2%β-巰基乙醇（V/V）和3%PVP-40（M/V）能夠提取到高質(zhì)量的基因組DNA，經(jīng)過AFLP的試驗(yàn)驗(yàn)證，該方法完全適合提取大麻干葉中基因組DNA來進(jìn)行AFLP分析。

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