黃麻染色體制備若干方法比較研究

陳 濤，徐建堂，陳燕萍，陳富成，祁建民

（福建農(nóng)林大學(xué)作物遺傳育種與綜合利用教育部重點實驗室，福州 350002）

黃麻（jute）為椴樹科（Tiliaceace）黃麻屬（Corchorus）一年生韌皮纖維作物，是世界上最重要的纖維作物之一，也是我國重要的特色經(jīng)濟(jì)作物。黃麻纖維具有產(chǎn)量高、纖維質(zhì)地柔軟、易染色、抗靜電、抑菌、可降解等優(yōu)良特點[1][2]。作為遺傳物質(zhì)的載體，染色體在植物種類鑒定、系統(tǒng)分類、遺傳學(xué)、進(jìn)化和遷移等相關(guān)研究中起重要作用[3]，且能夠為深入探討植物的起源、染色體水平的遺傳變異及其進(jìn)化機制等提供科學(xué)依據(jù)[4]，因此獲得清晰的黃麻中期染色體圖像，是進(jìn)行黃麻核型分析等研究的關(guān)鍵。國內(nèi)外有關(guān)黃麻屬染色體和核型系統(tǒng)分析的報道較少，Banerjee等首先報道了黃麻屬圓果種（C.capsularis L.）、長果種（C.olitoritus L.）和C.acutangulus這三個種的單倍染色體數(shù)為7[5]，黃麻染色體很小，屬于小染色體類[6]，對制片要求較高。隨著細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，本研究以圓果黃麻179為材料，比較了不同預(yù)處理條件下去壁低滲涂片法、去壁低滲懸液法、預(yù)先固定去壁低滲涂片法、不同酸解時間下的酸解離常規(guī)壓片法的制片效果，試圖找到最適合黃麻的中期分裂相清晰的染色體制備方法。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為圓果黃麻179品種，將少量種子用0.1%HgCl2溶液消毒10min，在清水中浸種過夜，放入底部墊有濾紙的培養(yǎng)皿中于28℃催芽。待根長至1.5cm左右時，取其距頂端3mm左右的根尖進(jìn)行預(yù)處理。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同預(yù)處理條件下的去壁低滲涂片法

參考李懋學(xué)方法[7]，將取下的黃麻179的根尖分別置于0.002mol.L-1 8-羥基喹啉溶液和0.2%的秋水仙素溶液的玻瓶中，前者浸泡3.5小時，后者浸泡2小時進(jìn)行預(yù)處理，溫度都保持在10℃-15℃。分別去掉預(yù)處理液，用0.075mol.L-1 KCl低滲液浸沒材料，25℃下處理30min進(jìn)行前低滲。倒去KCl溶液，用蒸餾水充分洗凈，加入混合酶（纖維素酶與果膠酶各占2.5%），26℃下酶解2小時。回收酶液，用蒸餾水分別慢洗3次，在25℃雙蒸餾水中停留10min進(jìn)行后低滲處理。將后低滲的材料用卡諾固定液在10-15℃下固定20小時以上。分別取3個固定后的根尖材料置于預(yù)先洗凈、冷凍的載玻片上，滴1滴卡諾固定液，并用鑷子敲碎涂抹，去掉大塊組織殘渣，在酒精燈火焰上掠過3次左右，使其干燥。將載玻片置于Giemsa染色液中25℃下染色4個小時以上，蒸餾水沖洗，空氣干燥后即可油鏡鏡檢，選擇分散良好、清晰的中期染色體再進(jìn)行顯微拍照。

1.2.2 去壁低滲懸液法

參考陳瑞陽方法[8]，將根尖用0.002mol.L-1 8-羥基喹啉溶液浸泡3.5小時作預(yù)處理，溫度保持在10℃-15℃。然后進(jìn)行前低滲、酶解去壁、后低滲處理，方法同1.2.1。倒去后低滲的雙蒸水，用鑷子將材料挾碎、攪拌，形成細(xì)胞懸液。再向黃麻179根尖細(xì)胞懸液加入適量卡諾固定液，10-15℃下靜置固定30min，吸取上層細(xì)胞懸液，去除大塊組織沉淀。將上層細(xì)胞懸液靜置25min，細(xì)胞沉淀后，輕輕地吸去上清液，留1mL左右細(xì)胞懸液為染色體標(biāo)本滴片備用。取一張預(yù)先洗凈并冷凍的清潔載玻片，滴2-3滴細(xì)胞懸液滴在玻片上，立即將玻片一端抬起，并輕輕吹氣，使細(xì)胞迅速分散，然后在酒精燈火焰上掠過3次左右，使其干燥。最后Giemsa染色、鏡檢過程的方法同1.2.1。

1.2.3 預(yù)先固定的去壁低滲涂片法

將根尖用0.002mol.L-1 8-羥基喹啉溶液浸泡3.5小時作預(yù)處理，溫度保持在10℃-15℃。雙蒸水洗凈后用新鮮的卡諾固定液，在10-15℃下固定20小時以上。接下來的前低滲、酶解去壁、后低滲、涂片、Giemsa染色、鏡檢等步驟方法同1.2.1。

1.2.4 不同酸解時間下的酸解離常規(guī)壓片法

參考王春臺方法[9]，將根尖用0.002mol.L-1 8-羥基喹啉溶液浸泡3.5小時作預(yù)處理，溫度保持在10℃-15℃。雙蒸水洗凈后用新鮮的卡諾固定液固定20小時以上，溫度以10-15℃為宜。倒去固定液，用蒸餾水洗3次。將根尖分成三份，再放入預(yù)熱的1 mol.L-1鹽酸中，60℃水浴中分別解離6min、8.5min、11min，然后分別用雙蒸水漂洗3次，每次5min。分別將根尖放于潔凈、冰冷的載玻片上滴加改良的石碳酸品紅染色，25℃染色2小時，蓋上蓋玻片，用鑷子輕輕敲打蓋玻片，然后用濾紙吸去多余染液，用鉛筆的橡皮頭敲打，使細(xì)胞分散。最后鏡檢、顯微拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同預(yù)處理方法對染色體制片效果的影響

在1.2.1實驗中，采用不同預(yù)處理方法，其他實驗步驟相同的條件下，對制片效果進(jìn)行比較（見圖1），圖1A為根尖用0.2%的秋水仙素溶液進(jìn)行預(yù)處理下的中期分裂相，染色體比較小，有收縮，邊緣模糊，縊痕不清晰，核型分析效果較差。圖1B為根尖用0.002mol.L-18-羥基喹啉溶液進(jìn)行預(yù)處理下的中期分裂圖像，染色體較大，背景清晰，縊痕明顯，分散度適當(dāng)，可作為核型分析。故在后續(xù)試驗中均用0.002mol.L-18-羥基喹啉溶液進(jìn)行預(yù)處理。

2.2 去壁低滲法中涂片法與細(xì)胞懸液滴片法的制片效果

圖2A和2B為都為細(xì)胞懸液滴片法處理下黃麻179染色體中期分裂圖像，相對于涂片法得到的圖1B，細(xì)胞懸液滴片法會使染色體分散度太大，可能造成染色體丟失。在挾碎細(xì)胞時可能會損毀染色體（如圖2B），而且使細(xì)胞碎片過多，圖像背景不清晰。比較可知，去壁低滲法中涂片比細(xì)胞懸液滴片的制片效果要好。

2.3 去壁低滲法中材料固定先后對制片效果的影響

圖3A和3B都為用預(yù)先固定的去壁低滲涂片法制得的黃麻179染色體中期分裂圖像，相對于采用后固定的去壁低滲涂片法制得的中期分裂圖像圖1B，圖3A和圖3B中的染色體分散程度太低，染色體粘在一起，核型分析效果相對較差。比較可知去壁低滲法中材料后固定比預(yù)先固定的制片效果要好。

2.4 不同酸解時間對制片效果的影響

圖4A為酸解5min的黃麻179染色體中期分裂圖像，染色體模糊，分散程度太低，染色過淺。圖4B為酸解8.5min的黃麻179染色體中期分裂圖像，染色體比較清晰，縊痕清晰，分散度適當(dāng)，背景清晰，可用于核型分析。圖4C酸解11min的黃麻179染色體中期分裂圖像，染色體已發(fā)生形變，大小不均勻，染色深淺不一。比較可知。酸解時間為8.5min時染色體制片效果較好。

3 討論

麻類染色體普遍較小，中期染色體通常在0.5-1.5 μm之間[10]，如此小的黃麻染色體要獲得比較好的中期分裂圖像，就必須做到染色體分散程度高，染色體不能收縮，背景要清晰。

圖1 用秋水仙素溶液（圖1A）和8-羥基喹啉溶液（圖1B）作預(yù)處理的中期分裂圖像Fig.1 Chromosomeinmetaphasestagepretreatedbycolchicinesolution（Fig.1A）and8-hydroxyquinolinesolution（Fig.1B）

圖2 圖2A、2B均為細(xì)胞懸液滴片法處理下黃麻179染色體中期分裂圖像Fig.2 The jute 179 chromosome in metaphase stage treated bycell hypotonic suspension method

圖3 圖3A、3B均為預(yù)先固定的去壁低滲涂片法制的黃麻179染色體中期分裂圖像Fig.3 Thejute179chromosomeinmetaphasestagetreatedbypre-fixedwalldegradationhypotonicsmearmethod

實驗過程中發(fā)現(xiàn)使用秋水仙素預(yù)處理時，濃度和處理時間要控制得當(dāng)，若秋水仙素濃度過低，就難以獲得較多的中期分裂相；若秋水仙素的使用濃度過高或處理時間太長，可能會引起染色體收縮成粒狀或短棒狀，影響制片效果。而8-羥基喹啉最大的優(yōu)點就是顯示縊痕、隨體清晰[11]，也不致引起染色體的粘連，本實驗也驗證了這一點。后固定的去壁低滲法因是活體原生質(zhì)，半滲透性好，吸水速度快，染色體因低滲作用而分散到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，所以染色體分散程度比較高，容易獲得比較好的染色體圖象。而先固定的去壁低滲法細(xì)胞固定后使細(xì)胞質(zhì)失去半滲透性，染色體難以隨低滲作用分散到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，所以在低滲吸水的時間需要很長的才會使細(xì)胞軟化膨脹，染色體分散的效果不是很好。去壁低滲中的涂片法比懸液法操作簡單，且能更容易找到中期分裂相，背景也較清晰，而實驗過程中懸液法需要的根尖材料比較多，挾碎過程中可能會損壞染色體。從本實驗結(jié)果來看，8-羥基喹啉處理下的后固定去壁低滲涂片法，相對其他的去壁低滲法制得的圖片效果更好，但實驗過程中酶解時間的控制是關(guān)鍵，需不斷摸索優(yōu)化。

酸解離常規(guī)壓片法比去壁低滲法操作上更簡便，時間更短，關(guān)鍵是酸解時間的控制。若鹽酸解離時間太短，染色不清晰，細(xì)胞質(zhì)也染上深淺不同的顏色；若處理時間過長，染色體染色極淡或不染色。這可能與酸解不夠，醛基暴露不充分有關(guān)，而呈現(xiàn)染色過淺。酸解過度，則使DNA完全解聚，糖與醛基之間的鍵被破壞，流離的核酸分子會擴散到細(xì)胞質(zhì)中，從而使染色淺或不均一[12]。本實驗發(fā)現(xiàn)酸解8.5min時制得的黃麻179染色體中期分裂圖像效果比較好。

通過比較這4種方法制得的中期圖片，筆者認(rèn)為酸解離常規(guī)壓片法最適合制備黃麻染色體中期圖片，此法制得的圖片效果較好、分散度適當(dāng)、縊痕清晰、形態(tài)良好、背景清楚，且此法操作比較簡單，快捷。黃麻屬于小染色體類，要獲得形態(tài)良好、分散適當(dāng)、著絲點清晰的染色體圖進(jìn)行核型分析，難度比較大，還需要不斷優(yōu)化制片技術(shù)，以求獲得更完美的染色體中期分裂圖像。

圖4 酸解6min（圖4A）、8.5min（圖4B）、11min（圖4C）的黃麻179染色體中期分裂圖像Fig.4 The jute 179 chromosome in metaphase stage byacid dissolution 6 minutes，8.5 minutes and 11 minutes respectively

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