于 淼， 徐海燕， 李 飛， 于治國， 趙云麗*

（1.沈陽藥科大學(xué)高職學(xué)院，遼寧沈陽 110026;2.沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧沈陽 110016）

本實(shí)驗(yàn)為當(dāng)歸寄生注射液指紋圖譜［1］的研究工作的一部分。當(dāng)歸寄生注射液，由當(dāng)歸和槲寄生兩味藥材組成，具有舒筋活絡(luò)、祛風(fēng)濕、鎮(zhèn)痛之功效，用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肥大性脊椎炎、腰膝勞損、腰腿痛、痛經(jīng)、坐骨神經(jīng)痛、神經(jīng)性頭痛等證的治療。方中當(dāng)歸為血中圣藥，具有補(bǔ)血活血、化瘀止痛、生肌健骨之功效，槲寄生具有益肝腎、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)益血之功效［2］。作者曾建立當(dāng)歸藥材的高效液相色譜指紋圖譜，為當(dāng)歸寄生注射液質(zhì)量控制提供依據(jù)［3］。近代化學(xué)成分和藥理研究表明，槲寄生主要化學(xué)成分有黃酮類、三萜類、苷類、甾醇類等多種化學(xué)成分，具有擴(kuò)張血管、鎮(zhèn)靜中樞等作用，同時(shí)有減少關(guān)節(jié)積液、改善關(guān)節(jié)骨端變性及骨質(zhì)疏松狀態(tài)、增寬狹窄的關(guān)節(jié)間隙等作用［4-5］。文獻(xiàn)報(bào)道，槲寄生藥材及其制劑的質(zhì)量控制方法主要是紫丁香苷和齊墩果酸的含量測(cè)定［6-7］。為全面地控制藥材質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)對(duì)10個(gè)產(chǎn)地的槲寄生藥材進(jìn)行了指紋圖譜研究及聚類分析。

1 儀器與試藥

LC-10ATvp輸液泵、SPD-10Avp紫外檢測(cè)器（日本島津公司），ANASTA色譜工作站（美國 Suntek Science公司），PHS-2TC精密數(shù)顯酸度計(jì)（上海之信儀器有限公司），電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

阿魏酸對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定用，批號(hào):0773-9910），乙腈、甲醇、四氫呋喃均為色譜純（天津市康科德科技有限公司），冰醋酸為分析純（天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心）。

槲寄生藥材（1-山東- 1;2-河北;3-山東-2;4-吉林;5-山東-3;6-山東泰安;7-遼寧鞍山;8-遼寧沈陽;9-山東五蓮縣;10-山西），由沈陽藥科大學(xué)孫啟時(shí)教授鑒定，粉碎過0.45 mm篩，置于干燥陰涼處備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性 色譜柱:Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相:以0.5%冰醋酸溶液（A）和甲醇-四氫呋喃（90∶10，v/v）（B）進(jìn)行梯度洗脫，程序?yàn)?～3 min，0%B;3 ～60 min，0%B ～40%B;檢測(cè)波長270 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:40℃;進(jìn)樣量:20 μL。理論塔板數(shù)以阿魏酸（20號(hào)峰）計(jì)不低于20 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取阿魏酸對(duì)照品約5.0 mg，加水制成每1 mL含50 μg阿魏酸的溶液。

2.2.2 供試品溶液 取槲寄生藥材5 g，加水75 mL煎煮2 h，濾過，濾渣加水50 mL煎煮2 h，合并濾液，減壓蒸餾至20 mL，加乙醇80 mL，靜置48 h，濾過，減壓蒸餾至15 mL，并定量稀釋至50 mL。將上述溶液與對(duì)照品溶液1∶1（v/v）混合后，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 儀器精密度試驗(yàn) 取1號(hào)藥材粉末，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果，各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD值為1.1% ～1.5%，相對(duì)峰面積RSD值為1.5%～2.9%。

2.4 方法重復(fù)性試驗(yàn) 取1號(hào)藥材粉末，按2.2項(xiàng)下方法平行制備5份供試品溶液，分別測(cè)定，各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD值為1.3%～1.9%，相對(duì)峰面積RSD值為1.7%～3.0%。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取1號(hào)藥材粉末，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫放置，分別于 0、2、4、8、10、24 h 進(jìn)樣分析，各色譜峰相對(duì)峰面積RSD值均為1.6% ～2.9%，表明供試品溶液室溫放置24 h穩(wěn)定。

2.6 槲寄生指紋圖譜的繪制及共有峰的確定 取不同產(chǎn)地槲寄生藥材10批，每批1份，按2.2項(xiàng)下方法分別制成供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定、記錄色譜圖。通過對(duì)比上述10個(gè)不同批次和產(chǎn)地的槲寄生藥材指紋圖譜，確定22個(gè)共有峰，其中20號(hào)峰為阿魏酸，將其作為參比峰。根據(jù)各色譜峰對(duì)參比峰的相對(duì)保留時(shí)間定性，各色譜峰相對(duì)參比峰的峰面積比值（X）定量。色譜圖見圖1（為5號(hào)樣品的色譜圖），相對(duì)峰面積結(jié)果見表1;各樣品出峰總數(shù)及其共有峰所占比例見表2。

表1 槲寄生藥材指紋圖譜共有峰相對(duì)峰面積

圖1 槲寄生高效液相指紋圖譜

表2 各樣品出峰總數(shù)及其共有峰所占比例

2.7 槲寄生藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)方法的確立

2.7.1 系統(tǒng)聚類分析 本研究以經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定的10個(gè)不同產(chǎn)地和批次的槲寄生樣品為研究對(duì)象，進(jìn)行指紋圖譜研究，獲得包括阿魏酸（20號(hào)峰）在內(nèi)的22個(gè)色譜峰。將各色譜峰相對(duì)于參比峰的峰面積量化，得到10×22階原始數(shù)據(jù)矩陣，運(yùn)用SPSS軟件對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，采用離差平方和法，利用歐氏距離作為樣品的測(cè)度。聚類分析將10個(gè)槲寄生樣品分為 2 類，其中 1、2、3、4、5、6、7、8、10 號(hào)樣品，列為

Ⅰ類，9號(hào)樣品列為Ⅱ類。聚類譜系圖見圖2。

圖2 槲寄生聚類譜系圖

2.7.2 相似度計(jì)算 結(jié)合聚類分析結(jié)果，從10個(gè)槲寄生藥材中，選取9號(hào)之外的其余9批藥材的指紋圖譜建立共有模式，采用夾角余弦、相關(guān)系數(shù)計(jì)算各樣品與共有模式之間的相似度。若樣品與共有模式間的夾角余弦和相關(guān)系數(shù)在0.80以上，則列為Ⅰ類;若低于0.80，則列為Ⅱ類。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相似度分析結(jié)果與系統(tǒng)聚類結(jié)果一致，兩種方法得到了相互驗(yàn)證。待測(cè)樣品獲取指紋圖譜數(shù)據(jù)后，計(jì)算其相似度即可評(píng)價(jià)其質(zhì)量。結(jié)果見表3。

表3 相似度檢驗(yàn)結(jié)果

3 討論

當(dāng)歸寄生注射液高效液相色譜指紋圖譜研究已對(duì)供試品溶液制備方法及色譜系統(tǒng)進(jìn)行考察，因需進(jìn)行當(dāng)歸寄生注射液及組方藥味的相關(guān)性研究，本文采用相同的制備方法及色譜條件。

對(duì)比10批槲寄生藥材圖譜，山東五蓮縣槲寄生樣品的圖譜明顯不同，相似度明顯低于其它批。此外，山東五蓮縣槲寄生外觀不同于其他樣品，呈扁枝狀金黃色，而其它的槲寄生藥材呈圓枝狀棕黃色。根據(jù)扁枝槲寄生的外觀性狀的鑒別條件為莖基部圓柱形，具二棱，小枝扁平，綠色，每一節(jié)間呈矩圓狀倒披針形或近條形，上寬下狹，脈兩面具多條，葉退化成鱗片狀這些特點(diǎn)后經(jīng)孫啟時(shí)教授驗(yàn)證其為扁枝槲寄生。

除9號(hào)樣品外，10號(hào)樣品的相似度也明顯低于其他幾批樣品，如果將相似度控制在0.90，那么10號(hào)樣品也會(huì)被單獨(dú)列為一類，所以在使用類似這樣的樣品時(shí)應(yīng)慎重考慮。

［1］于 淼，于治國，趙云麗，等.當(dāng)歸寄生注射液指紋圖譜研究［J］.中成藥，2004，26（8）:607-609.

［2］李正華，詹 奇，粱 篤.補(bǔ)骨方治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的療效觀察［J］.現(xiàn)代醫(yī)院，2004，14（4）:12.

［3］于 淼，李 飛，于治國，等.當(dāng)歸藥材中水溶性成分指紋圖譜的分析［J］.中國冶金工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2008，25（1）:20-22.

［4］趙 晶，賀江萍.槲寄生的化學(xué)成分及藥理作用研究［J］.天津中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，24（3）:185-186.

［5］王 俊，王國基，顏 輝，等.槲寄生的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2005，16（4）:300-303.

［6］徐建富，杜秀寶，孔景臨，等.RP-HPLC測(cè)定槲寄生中紫丁香苷的含量［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2004，11（2）:49-50.

［7］劉順航，王俊全，劉 巖，等.高效液相色譜法測(cè)定槲寄生中齊墩果酸的含量［J］.中成藥，2008，30（6）:926-928.