鹽酸去氫駱駝蓬堿乳膏處方篩選及其止癢藥效學研究

丁志榮， 滕 亮*， 戴秀勇， 于富生

（1.新疆醫(yī)科大學藥學院，新疆烏魯木齊 830054;2.新疆華圣元醫(yī)藥科技有限公司，新疆烏魯木齊 830011）

去氫駱駝蓬堿（Harmine，HM）為β－咔保林類生物堿，廣泛存在于世界各地的多種天然植物中，在蒺藜科（Zygophyl laceae）植物駱駝蓬（Peganum harmalaL）的種子中含量較高且結構穩(wěn)定［1］。駱駝蓬屬（Peganum）為蒺藜科（Zygophyl laceae）多年生草本植物，在我國作為民間藥或民族藥使用已有很長的歷史，資源豐富，蘊藏量大，其種子中的化學成分主要為咔保啉類生物堿，如駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬堿［2］等，其中去氫駱駝蓬堿（Harmine，Har）含量最高。該生物堿具有抗菌、抗炎鎮(zhèn)痛止癢［3］、抗原蟲及抗腫瘤等作用［4］。近年來國內外對其抗腫瘤作用研究較多，但對其止癢等作用研究較少，同時因其本身嚴重的中樞神經系統(tǒng)毒性作用限制了它作為發(fā)揮全身作用的藥物品種的開發(fā)，因此本課題以外用鹽酸去氫駱駝蓬堿乳膏劑為研究對象，通過優(yōu)選乳膏劑處方工藝并對其止癢藥效學進行研究達到拓寬其臨床應用范圍、提高臨床用藥價值的目的［5］。

1 材料與儀器

1.1 藥品與試劑

鹽酸去氫駱駝蓬堿（Harmine HCl）:藥劑教研室提取精制（純度＞99%）;單硬脂酸甘油酯、蜂蠟、司盤－60、吐溫－80、氮酮、凡士林、甘油等均為藥用規(guī)格;皮炎平軟膏（三九醫(yī)藥股份有限公司，批號:0803301）;磷酸組胺（上海藍技科技發(fā)展有限公司，批號:080314）;五羥色胺（美國sigma公司，批號:028k5152）。

1.2 動物

昆明種小鼠，♀♂各半，體重（20±2.0）g，新疆實驗動物研究中心提供。

1.3 儀器

水浴鍋（上?，樮幵囼炘O備有限公司），攪拌器（RW20.n），LVDVE旋轉黏度計（美國博力飛公司），顯微鏡（上海第三光學儀器廠，XSP－4C），藥品穩(wěn)定性試驗箱（重慶市永生實驗儀器廠，SHH－250 SD）），離心機（北京醫(yī)用離心機廠，LDZ4－0.8自動平衡），分析天平（JM－5102浙江余兆紀銘稱重檢驗設備有限公司）。

1.4 材料

細砂紙;剪刀;1 mL注射器。

2 方法與結果

2.1 均勻試驗優(yōu)選鹽酸去氫駱駝蓬堿乳膏處方組成

2.1.1 乳膏制備工藝［6］取單硬脂酸甘油酯、凡士林、蜂蠟、司盤－60、氮酮混合后，水浴加熱至80°C，另取 Harmine堿、甘油、吐溫－80混合后加蒸餾水溶解，水浴加熱至82°C。在攪拌狀況下將水相緩緩加入油相，不斷攪拌至室溫即得鹽酸去氫駱駝蓬堿乳膏。

2.1.2 評價體系的建立

2.1.2.1 綜合評分的計算 本試驗采用綜合評分值作為乳膏劑處方篩選的指標。采用外觀觀察、涂布性觀察反映乳膏劑的適用性，采用高溫試驗、離心試驗反映乳膏劑的物理穩(wěn)定性，同時還考察了對乳膏劑的適用性及物理穩(wěn)定性均有影響的均勻性、黏度及粒徑。預試驗表明各樣品乳膏對高溫試驗很敏感，且乳膏劑的穩(wěn)定性是評價乳膏劑質量的重要指標，故在綜合評分中賦予高溫試驗結果的權重值為0.8;粒徑、黏度和離心試驗也是影響乳膏穩(wěn)定性和適用性的主要因素，但樣品對三種指標的敏感性較差，故在綜合評分中分別賦予的權重值為0.05;外觀、均勻性和涂布性主要影響乳膏適用性，但三者的測量誤差較大，樣品對三種指標的敏感性較差，故在綜合評分中分別賦予三者的總權重值為0.05。從乳膏的穩(wěn)定性與適用性綜合考慮，并結合預試驗結果對樣品乳膏分別進行外觀觀察、涂布性觀察、均勻性測定、黏度測定、粒徑測定、高溫試驗、離心試驗并按下式計算綜合評分。

2.1.2.2 外觀 肉眼觀察呈半固體狀，亮白，流動性越小、細膩程度高、肉眼觀察無顆粒者分值越高。

2.1.2.3 涂布性 挑取乳膏少許涂于手背部皮膚，1 min內能夠涂抹開吸收視為易于涂布，分值最高。

2.1.2.4 均勻性 肉眼觀察結果占50分，應均勻無結塊;10×10倍鏡下觀察結果占50分，粒子應無凝集，分五等（無凝集－，凝集+，凝集++，凝集+++，凝集++++），肉眼與鏡下觀察結果相結合計算總分。

2.1.2.5 黏度 于5 mL離心管裝滿待測乳膏，將4號轉子緩慢旋下置于乳膏中，以乳膏覆蓋至轉子刻度且不觸碰離心管壁為準，調節(jié)轉速，待黏度計數顯屏數字不變化時讀取黏度。以200 Pa·s為滿分，100 Pa·s和300 Pa·s各為50分，黏度過大或過小分值遞減，黏度每變化2 Pa·s，分值變化1分。2.1.2.6 粒徑 參照《中國藥典》（2005版）二部附錄ⅨE粒度和粒度分布測定法第一法（顯微鏡法）測定粒度，先用1號測微尺對2號測微尺進行標定，觀察時用2號測微尺進行粒徑測量，記錄讀數D，然后用標定的結果將讀數D換算成微米，粒徑越小越好，50 μm為60分，每減少或增加1 μm則分值增加或減少1分。

2.1.2.7 高溫試驗 于5 mL離心管填裝待測乳膏至刻度，置于藥品穩(wěn)定性試驗箱中，調節(jié)溫度55℃恒溫保存6 h，乳膏無分層現(xiàn)象為滿分，分層體積越大分值越低，分層超過1 mL為0分。

2.1.2.8 離心試驗 于5 mL離心管填裝待測乳膏至刻度，置于離心機中以2 500 r/min的轉速離心0.5 h，乳膏無分層現(xiàn)象為滿分，分層體積越大分值越低，分層超過1 mL為0分。

2.1.3 均勻試驗優(yōu)選鹽酸去氫駱駝蓬堿乳膏處方組成 預實驗表明處方中的蜂蠟、司盤－60、吐溫－80為影響乳膏制劑外觀及穩(wěn)定性的主要影響因素，故采用U5（53）均勻試驗優(yōu)選鹽酸去氫駱駝蓬堿乳膏處方組成。因素水平見表1，試驗安排及結果見表2。

表1 因素水平表

以綜合評分為評價指標，采用沈陽藥科大學均勻設計軟件進行多元回歸處理，得回歸方程:Y=－107.379 0 + 37.810 0X2+ 178.196 2X3－46.453 1X23，復相關系數 R2=0.999 9，s=0.384 4，回歸方程顯著性檢驗F=1 013.945 5，方程顯著（P＜0.05）。優(yōu)化值為:X1=6.138，X2=1.128，X3=1.933，預測最大值為106.147，預測區(qū)間（104.898，107.397）。

2.1.4 驗證試驗 采用優(yōu)化處方用2.1.1項下方法制備三批乳膏，對樣品乳膏分別進行外觀觀察、涂布性觀察、均勻性測定、黏度測定、粒徑測定、高溫試驗、離心試驗并進行百分制評分，計算綜合評分，結果如表3。

表2 U5（53）均勻試驗安排及結果

表3驗證試驗結果

三批乳膏綜合評分平均值為98.4±50，RSD（%）=0.51，說明優(yōu)選處方穩(wěn)定、合理、可行。

2.2 鹽酸去氫駱駝蓬堿乳膏止癢藥效學研究

2.2.1 鹽酸去氫駱駝蓬堿乳膏制備 按優(yōu)化處方采用“2.1.1”項下方法制備高、中、低劑量鹽酸去氫駱駝蓬堿乳膏，分別含鹽酸去氫駱駝蓬堿0.25%、0.5%、0.75%，備用。

2.2.2 鹽酸去氫駱駝蓬堿乳膏對磷酸組胺所致皮膚瘙癢的影響［7］

2.2.2.1 動物分組 昆明種小鼠60只，隨機分為6組，每組10只，♀♂各半。模型對照組動物只造模不用藥，陽性對照組用皮炎平軟膏0.003 75 mg/g，基質組用空白基質5 mg/g，試驗藥物分3個劑量組:低劑量組0.012 5 mg/g、中劑量組0.025 mg/g、高劑量組0.037 5 mg/g。

2.2.2.2 磷酸組胺所致皮膚瘙癢動物模型 用細砂紙打磨小鼠右后足背部皮膚，以皮膚發(fā)紅滲血不出血為度，抽取0.02%的磷酸組胺0.1 mL滴于打磨過的皮膚之上，立即觀察記錄15 min內小鼠的瘙癢次數及持續(xù)時間。瘙癢指征為小鼠回頭舔啃右后足背皮膚;瘙癢持續(xù)時間間隔3 s以上記兩次次瘙癢，小于3 s記一次瘙癢。

2.2.2.3 試驗方法 藥物組、陽性對照組、基質組、涂抹于小鼠右后足背部皮膚并輕柔片刻至吸收，30 min后造模，觀察記錄15 min內小鼠的瘙癢次數及持續(xù)時間。結果見表4。

表4 鹽酸去氫駱駝蓬堿乳膏對磷酸組胺所致皮膚瘙癢的影響

2.2.3 鹽酸去氫駱駝蓬堿乳膏對五羥色胺所致皮膚瘙癢的影響［7］

2.2.3.1 動物分組 昆明種小鼠72只，隨機分為6組，每組12只，♀♂各半。模型對照組動物只造模不用藥，陽性對照組用皮炎平軟膏0.003 75 mg/g，基質組用空白基質5 mg/g，試驗藥物分3個劑量組:低劑量組0.012 5 mg/g、中劑量組0.025 mg/g、高劑量組0.037 5 mg/g。

2.2.3.2 5－羥色胺所致皮膚瘙癢動物模型 吸取0.5 mg/mL的五羥色胺0.05 mL注射于小鼠右后足墊內，立即觀察記錄1 h內小鼠的瘙癢次數及持續(xù)時間，瘙癢指征為小鼠回頭舔啃右后足背皮膚;瘙癢持續(xù)時間間隔3 s以上記兩次次瘙癢，小于3 s記一次瘙癢。

2.2.3.3 試驗方法 藥物組、陽性對照組、基質組、涂抹于小鼠右后足背部皮膚并輕柔片刻至吸收，30 min后造模，觀察記錄1 h內小鼠的瘙癢次數及持續(xù)時間。結果見表5。

表5 鹽酸去氫駱駝蓬堿乳膏對五羥色胺所致皮膚瘙癢的影響

3 討論

3.1 預試驗結果表明單硬脂酸甘油酯和凡士林在不同的比例下均能制備出得分較高的乳膏，屬于非主要影響因素，故在均勻試驗中將單硬脂酸甘油酯的用量固定為8%，凡士林用量固定為5%。

3.2 以往乳膏劑處方工藝篩選指標多采用單一的穩(wěn)定性指標或物理性能指標，無法全面反映乳膏劑的穩(wěn)定性、工業(yè)化生產的可行性及使用的適應性。預實驗結果也表明采用單一指標對乳膏進行評價都是相對片面的，因此建立可用于乳膏劑處方篩選與工藝優(yōu)選的客觀評價指標體系很有必要。本課題在進行了大量預實驗的基礎上篩選出主要評價指標，將主客觀評價指標具體量化，并賦予不同權重，運用綜合評分法建立了一套以相對客觀的穩(wěn)定性指標（高溫與離心試驗）、物理特性指標（黏度、粒徑）為主，以外觀、涂布性等與乳膏使用密切相關的主觀指標為輔的乳膏客觀評價指標體系，用以全面評價各處方樣品乳膏。

乳膏劑是經乳化而形成的非均相分散體系，熱力學、動力學均不穩(wěn)定。因此在建立評價指標體系時對乳膏劑的穩(wěn)定性進行了細致的考察，結果表明各處方乳膏劑對高溫條件非常敏感，對離心試驗較敏感，而對低溫環(huán)境不敏感，故低溫試驗結果不計入綜合評分。同時試驗還表明各處方乳膏劑對黏度、粒徑、外觀、涂布性較敏感。此外，客觀指標較主觀指標而言更為準確，可信程度更高。因此結合指標的敏感性與準確性給各指標賦予不同的權重值，驗證試驗也表明該綜合評分體系可以較好的評價乳膏劑質量。

3.3 藥效試驗結果表明就動物瘙癢次數而言，基質組與模型組無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），對照組、高、中、低劑量的藥物組與模型組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示三個劑量的藥物及對照品對磷酸組胺、五羥色胺引起的瘙癢均有抑制作用，且藥物作用不受基質的影響。其中藥物的高劑量組與陽性對照組止癢效果有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），提示藥物高劑量組減少瘙癢次數的作用優(yōu)于對照組。就動物瘙癢持續(xù)時間而言，僅藥物的高劑量組與模型組有顯著統(tǒng)計學差異（P＜0.01），其余組與模型組對比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。綜上所述鹽酸去氫駱駝蓬堿乳膏具有明顯的止癢作用，其中高、中劑量組減少瘙癢次數的效果優(yōu)于陽性對照組，但僅有高劑量組可顯著縮短動物的瘙癢時間。

3.4 參考文獻［7］的實驗條件并結合預試驗結果制作磷酸組胺所致皮膚瘙癢動物模型與5－羥色胺所致皮膚瘙癢動物模型。磷酸組胺與5－羥色胺均為導致瘙癢的炎性介質。磷酸組胺所致皮膚瘙癢動物模型致癢作用穩(wěn)定迅速，觀察時間短，操作簡單，可以作為快速考察藥物止癢作用的動物模型。5－羥色胺模型致癢作用相對緩慢，但致癢時間長，可與磷酸組胺模型結果結合說明藥物的止癢作用。

致謝:新疆華圣元醫(yī)藥科技有限公司給予本課題大力支持。

［1］胡承波，梅 林，龍 春.中藥駱駝蓬的研究進展［J］.綜述報告，2007，16（8）:61－63.

［2］張學農，孫殿甲，孟 怡.駱駝蓬生物堿提取方法的研究［J］.新疆醫(yī)學院學報，1993，16（4）:350－351.

［3］陳蔚如，張海麗，張 巖，等.去氫駱駝蓬堿在小鼠的抗炎鎮(zhèn)痛及止癢作用［J］.天津醫(yī)藥，2004，32（11）:681－683.

［4］潘啟超，楊小平，李春杰，等.駱駝蓬總堿藥理作用的研究［J］.中山醫(yī)科大學學報，1997，18（3）:165－167.

［5］李婭芳，鄧英杰，劉書琴.透皮吸收劑研究進展［J］.中國藥學雜志，1997，32（1）:6.

［6］邢建國，孫殿甲，管 慧，等.鹽酸去氫駱駝蓬堿軟膏的處方篩選［J］.中成藥，2001，5（23）:316－318.

［7］沈非沉，王 暉，薛漫清，等.瘙癢動物模型的研究進展［J］.中國比較醫(yī)學雜志，2007，3（17）:182－185.