劉詩青，夏新華，彭買姣，李淑輝，鄒婉婷

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南長沙 410208)

殼聚糖用于湘A-1號(hào)顆粒劑的絮凝工藝研究

劉詩青，夏新華*，彭買姣，李淑輝，鄒婉婷

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南長沙 410208)

湘A－1號(hào)顆粒劑;殼聚糖;絮凝澄清工藝;黃芩苷;高效液相色譜法

目的:優(yōu)選湘A－1號(hào)顆粒劑的絮凝澄清工藝。方法:在考察殼聚糖加入量、提取液濃度、pH值、溫度、攪拌等因素后，采用正交試驗(yàn)對(duì)殼聚糖加入量、提取液濃度、pH值三因素進(jìn)一步優(yōu)化。結(jié)果:湘A－1號(hào)顆粒劑絮凝澄清工藝條件為:殼聚糖加入量0.8 mL/g，提取液濃度1∶6，不調(diào)pH值，溫度60℃，攪拌速度350 r/min，攪拌15 min。結(jié)論:殼聚糖絮凝澄清法可用于湘A－1號(hào)顆粒劑的純化工藝。

湘A－1號(hào)顆粒劑主要由黃芩、薏苡仁、虎杖等藥材組成，對(duì)艾滋病有一定的防治作用。其中，黃芩具有清熱燥濕，瀉火解毒的作用，其主要成分黃芩苷具有抗菌、消炎之作用。現(xiàn)代藥理研究證明，黃芩苷在細(xì)胞培養(yǎng)中能抑制HIV逆轉(zhuǎn)錄酶和細(xì)胞病變，抑制病毒熒光抗原，P24抗原和成人T淋巴細(xì)胞白血病病毒，抑制HIV在HO細(xì)胞中生長［1］。本研究采用殼聚糖對(duì)處方藥材水提液進(jìn)行絮凝澄清，并對(duì)澄清工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。

1 儀器與試藥

1.1 儀器島津LC－10AT型高效液相色譜儀，島津SPD－10A型紫外檢測(cè)器，N－3000色譜工作站;UV1102型紫外/可見分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器有限公司);80－1型離心沉淀機(jī)(江蘇金壇市中大儀器廠);DF－101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市英峪予華儀器廠)。

1.2 試藥黃芩苷對(duì)照品(批號(hào)110715－200514，中國藥品生物制品檢定所);殼聚糖(批號(hào)20080322，浙江澳興生物科技有限公司);甲醇(SK Chemicals)為色譜純;其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品溶液的測(cè)定

2.1.1 樣品溶液的制備將處方中各藥材按本制劑提取工藝進(jìn)行提取，并濃縮至一定濃度，即得。

2.1.2 吸光度的測(cè)定量取樣品溶液適量，以蒸餾水為空白，于650 nm下測(cè)定。

2.1.3 固形物保留率的測(cè)定分別量取絮凝前后的樣品溶液25.0 mL，置于恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，干燥至恒重后稱定重量，計(jì)算。

2.1.4 黃芩苷保留率的測(cè)定

色譜條件:色譜柱:Apollo C18－A柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇－水－磷酸(47∶53∶0.2);檢測(cè)波長:280 nm;流速:1 mL/min;柱溫:30℃;理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算不低于2500。

對(duì)照品溶液的制備:精密稱取黃芩苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.056 mg的溶液，即得。

供試品溶液的制備:精密量取樣品溶液5 mL，加5 mL的甲醇，離心10 min，取上清液1 mL置10 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，用0.45 um微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定黃芩苷峰面積積分值，計(jì)算。

2.2 提取液絮凝澄清工藝的優(yōu)選

2.2.1 殼聚糖溶液的制備取殼聚糖1 g，溶于100 mL 1%的HAc溶液中，靜置溶脹24 h，即得。

2.2.2 殼聚糖加入量的考察取濃度為1∶6(生藥量g:藥液體積mL)的提取液100 mL，平行5份，于磁力攪拌器上加熱恒溫至60℃，在攪拌速度350 r/min下，分別按0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL/g(殼聚糖溶液體積/生藥量)加入殼聚糖溶液，攪拌10 min，靜置12 h。取上清液于1 cm吸收池，650 nm波長處測(cè)定吸光度，結(jié)果見圖1(a)?？梢?，當(dāng)加入量為0.8 mL/g時(shí)提取液吸光度最低。

2.2.3 提取液濃度、pH值、溫度和攪拌的考察見圖1。取提取液適量，殼聚糖加入量為0.8 mL/g，其余按試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行，基本操作同2.2.2項(xiàng)下方法。結(jié)果表明，當(dāng)提取液濃度為1∶6時(shí)吸光度最低，見圖1(b);pH值在5～8時(shí)吸光度較低，其中pH7時(shí)吸光度最低，見圖1(c);溫度為60℃時(shí)吸光度最低，見圖1(d);攪拌速度為350 r/min，攪拌15 min時(shí)，提取液吸光度最低，見圖1(e)、圖1(f)。

圖1 殼聚糖用于湘A-1號(hào)顆粒劑絮凝澄清工藝的考察

2.2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化絮凝澄清工藝在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)法，以吸光度、固形物保留率及黃芩苷保留率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)殼聚糖加入量、提取液濃度、pH值三因素進(jìn)一步優(yōu)化，(見表1)，按L9(34)正交表安排試驗(yàn)，其余基本操作同2.2.2項(xiàng)下方法。以吸光度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，由直觀分析(見表2)可知，最佳絮凝澄清工藝條件為A2B3C3，但方差分析表明各因素對(duì)吸光度無顯著性影響(見表3);以固形物保留率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，最佳絮凝澄清工藝條件為A1B2C2，但方差分析表明各因素對(duì)固形物保留率亦無顯著性影響(見表4);而以黃芩苷保留率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，其最佳絮凝澄清工藝條件為A2B2C1，其中A、C因素經(jīng)方差分析表明對(duì)黃芩苷保留率有顯著性影響(見表5);綜上，可確定絮凝澄清工藝條件為A2B2C1，即:取1∶6的提取液，加熱至60℃，恒溫，在攪拌速度為350 r/min下，按0.8 mL/g，緩慢滴加1%殼聚糖溶液，攪拌15 min，靜置12 h后濾過，即得。

表1 絮凝澄清工藝正交試驗(yàn)因素水平表

表2 絮凝澄清工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 吸光度方差分析

表4 固形物保留率方差分析

表5 黃芩苷保留率方差分析

2.3 絮凝澄清法與醇沉法的比較取1∶6的提取液，按上述優(yōu)選的絮凝澄清工藝條件進(jìn)行絮凝;另取相對(duì)密度約為1.20的提取液，慢加快攪方式加入95%的乙醇，使提取液的含醇量達(dá)到50%，于冰箱中靜置24 h;分別測(cè)定吸光度，并離心、濾過、定容、測(cè)定固形物保留率及黃芩苷保留率。結(jié)果表明，以黃芩苷保留率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，絮凝澄清法較醇沉法能更多的保留有效成分(見表6)，經(jīng)t檢驗(yàn)亦顯示絮凝澄清法與醇沉法有顯著性差異(P＜0.05)。

表6 絮凝澄清法與醇沉法的比較

3 討論

在中藥的純化工藝中，運(yùn)用水提醇沉去除中藥材提取液中無效成分的同時(shí)，也造成了有效成分的大量損失，難以保證成品制劑的有效性，且成品的穩(wěn)定性較差;而運(yùn)用絮凝澄清法可選擇性的除去無效成分，提高有效成分的含量，保證成品質(zhì)量的穩(wěn)定性［2］。甲殼素類澄清劑是近年來應(yīng)用最為廣泛的新型絮凝劑，因其來源廣泛、價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)便，安全無毒越來越受到人們的重視。

本實(shí)驗(yàn)中，吸光度反映的是提取液經(jīng)絮凝后，其體系中的懸浮物及膠體粒子的沉降情況，沉降效果越好，上層液越澄清，吸光度越小;固形物保留率反映的是提取液經(jīng)絮凝后，再經(jīng)離心濾過去除不溶性物質(zhì)后所含浸出物的總量。

實(shí)驗(yàn)中攪拌應(yīng)以不起泡沫為度，否則，泡沫難以消失，絮凝雜質(zhì)會(huì)集聚在泡沫周圍形成懸浮物，影響后續(xù)工藝。對(duì)于殼聚糖的用量，應(yīng)考慮殼聚糖對(duì)不同的化學(xué)成分的吸附能力差異，尤其對(duì)水溶性較小的有效成分，使用殼聚糖作為澄清劑時(shí)應(yīng)當(dāng)慎重。

［1］徐淑玲，關(guān)崇芬，翁新愚，等.扶正祛邪中藥復(fù)方對(duì)猴艾滋病模型實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2003，9(1):42－44.

［2］吳英，侯麗光.中藥澄清技術(shù)在中藥制劑過程中的應(yīng)用［J］.牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，25(4):51－53.

R284.1

B

1001－1528(2010)05－0873－03

2009－05－16

湖南省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研專項(xiàng)基金(6201－5)

劉詩青(1985－)，女，碩士研究生，主要從事中藥制備工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，E－mail:liushiqing86@126.com

*通訊作者:夏新華，男，博士生導(dǎo)師。Tel:(0731)88458305，E－mail:xiaxinhua001@163.com