水通道AQP2在多囊腎上皮中的表達及意義

楊龍飛,朱 娜,宗敏茹,何成彥,馮學(xué)超*

(1.東北師范大學(xué)膜通道實驗室,吉林 長春130024;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院,吉林 長春130033)

多囊腎病(Polycystic kidney disease,PKD)是一種常見的嚴(yán)重危害人類健康的遺傳疾病,以雙側(cè)腎臟腎小管形成多個進行性增大的囊腫為主要特征,是終末期腎衰的主要原因之一[1]。研究證明,多囊腎形成過程中,涉及囊腔液中cAMP濃度異常增高、cAMP依附的氯離子等通道持續(xù)開放Cl-、Na+和水分子向囊腫內(nèi)持續(xù)過程,造成積液增多和囊腫不斷增大[2-4]。進而使腎臟體積增大并壓迫腎實質(zhì),造多錢成腎功能損害,由此可見,在多囊腎形成過程中,水分子持續(xù)跨膜轉(zhuǎn)運具用重要作用。

為了研究水通道蛋白2(AQP2)在多囊腎形成中的作用,本文對水通道蛋白AQP2在多囊腎囊腫上皮中表達情況進行研究,為確定水通道是否參與多囊腎的形成過程及其在該過程中的作用奠定基礎(chǔ),同時也為多囊腎疾病提供新的分子機理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 總 RNA提取試劑盒(RNeasy micro kit,QIAGEN)、First strand cDNA amplification kit(Invitrogen)、核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)品(λ-Hind Ⅲ +φ X174-HaeⅢdigest,TaKaRa),兔抗人水通道AQP2抗體(Santa)為一抗,辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔抗體(HRPGoat Anti-rabbit IgG)(Sigma)為二抗。

1.1.2 設(shè)備 Legend Micro 17R高速冷凍離心機(Sorvall,美國)、DU640分光光度計(Beckman Culture,美國)、PTC100 PCR儀(MJ Reseach,Inc.,美國)、FluorChem HD2凝膠成像分析系統(tǒng)(Alpha Innotech,,美國)、LEICA SM 2000R 切片機(leica,德國)、T10高速組織勻漿器(IKA,德國)。

1.1.3 標(biāo)本 多囊腎組織和分離的單個囊腫來自臨床上接受腎移植或由于并發(fā)癥而部分或全部切除的病腎,陰性對照取自肝病患者手術(shù)切除的病灶旁組織,陽性對照取自非多囊腎腎病患者手術(shù)切除的病灶旁組織,所有標(biāo)本的取得事先均征得患者同意。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞總RNA提取 在顯微鏡下分離足夠數(shù)量的腎囊腫,然后用高速組織勻漿器進行勻漿,用RNA提取試劑盒提取總RNA。1%非變性瓊脂糖凝膠,電泳后,經(jīng)溴化乙錠染色,凝膠成相儀掃描后觀察結(jié)果。

1.2.2 RT-PCR檢測 將上述所得RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以此cDNA為模板,用人AQP2特異性引物對cDNA進行PCR擴增,AQP2引物序列為:forward 5′-AGCTGGTGCTCTGCATCTTCG-3′,reverse 5′-AGGCTCTTGGCTGGCGGAAAC-3′。 擴 增 產(chǎn) 物 為cDNA 3'端約300 bp大小的片段。RT-PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳分離檢驗,用同樣方法檢測陰性對照和陽性對照。

1.2.3 免疫組織化學(xué)分析 將新鮮囊腫組織放入10%中性甲醛中固定24 h,然后按常規(guī)方法脫水、透明、浸蠟、包埋、切片并用一抗及二抗進行免疫染色,最后進行封片鏡檢。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞總RNA提取 將提取的囊腫組織總RNA用1%非變性瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,電泳結(jié)果顯示RNA是完整未降解(28S、18S和5S核糖體RNA泳帶均清晰,未見降解)(圖1A)。其260 nm和280 nm吸光度的比值OD260/280為1.96,表明提取的RNA純度較高,可用于cDNA合成。

2.2 囊腫組織中水通道的表達 應(yīng)用人AQP2特異性引物對新鮮囊中組織進行RT-PCR分析,以肝臟組織為陰性對照,以非多囊腎腎組織為陽性對照,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在水通道AQP2在囊腫中表達較高(圖1B);免疫組織化學(xué)結(jié)果也顯示AQP2在囊腫組織上皮中高表達,尤其值得注意的是:AQP2在上皮細(xì)胞近囊腔側(cè)膜的表達水平明顯高于胞漿(圖2A、2B)。

圖1 水通道AQP2在多囊腎囊腫上皮中表達的RT-PCR分析結(jié)果

3 討論

圖2 水通道AQP2在多囊腎囊腫上皮中表達的免疫組織化分析結(jié)果

水通道蛋白廣泛表達于與體液分泌和吸收密切相關(guān)組織的多種上皮和內(nèi)皮細(xì)胞膜上,參與多種生理病理過程。正常腎臟中,水通道AQP2主要表達于集合管上皮細(xì)胞內(nèi)囊泡膜上[5],本研究發(fā)現(xiàn)水通道AQP2高表達在源于腎小管的囊腫上皮細(xì)胞上,提示AQP2可能參與多囊腎的形成過程,深入研究AQP2在多囊腎形成中的作用,可能為多囊腎疾病形成的分子機理提供了新的內(nèi)容。

在正常情況下,腎臟中集合管上皮細(xì)胞的管腔側(cè)膜及近管腔側(cè)的胞漿囊泡內(nèi)的AQP2主要受血管加壓素的調(diào)節(jié),通過穿梭機制參與尿液水分的重吸收,維持機體水分平衡[6,7]。在此過程中,血管加壓素激活V2受體而產(chǎn)生第二信使cAMP是AQP2功能的直接調(diào)控因素。因此,多囊腎囊腔中異常高濃度的cAMP也可能參與囊腔中AQP2功能調(diào)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)AQP2在上皮細(xì)胞近囊腔側(cè)膜的表達水平明顯高于胞漿的事實也間接證明多囊腎囊腔中的cAMP參與囊腔AQP2功能調(diào)節(jié)。

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