樊 平 康云霄 石葛明 王 磊 張國梁 李 錦

(河北醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物研究室,河北 石家莊 050017)

研究顯示,老年人多有排尿障礙,隨著衰老而出現(xiàn)尿頻、尿不盡等癥狀〔1〕,老年大鼠也有類似的排尿障礙〔2〕,這可能與排尿的神經(jīng)調(diào)節(jié)或排尿器官的衰老性改變有關(guān)。脊髓參與排尿控制的傳出核團(tuán)位于腰骶膨大處,這些排尿相關(guān)核團(tuán)接受許多下行纖維的支配,其中 5-羥色胺(5-HT)能神經(jīng)纖維的信息傳遞在排尿控制中起著十分重要的作用〔3～6〕。腰骶髓排尿相關(guān)核團(tuán) 5-HT能神經(jīng)體系是否隨衰老出現(xiàn)表達(dá)降低尚不清楚。本研究利用免疫組織化學(xué)方法分析老年大鼠腰骶髓排尿相關(guān)核團(tuán) 5-HT神經(jīng)體系特異性標(biāo)記物 5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(serotonin transporter,SERT)免疫陽性纖維和膨體分布及反應(yīng)強(qiáng)度的變化,探討老年排尿障礙的神經(jīng)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物 選取 3月齡和 24月齡健康雄性 Wistar大鼠 12只,由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供,每月齡組各 6只。

1.2 儀器與試劑 CM1850恒冷箱冷凍切片機(jī)(德國 Leica公司產(chǎn)品),HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)(武漢長?？萍加邢挢?zé)任公司產(chǎn)品);多克隆兔抗 SERT抗體購自美國 ImmunoStar公司,山羊抗兔生物素化二抗及鏈霉親和素-過氧化物酶復(fù)合物購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)及圖像分析 所有大鼠于深麻醉下以 4%多聚甲醛常規(guī)經(jīng)心灌注固定,取第 1、第 2腰髓節(jié)段(L1～L2)和第 6腰髓到第 1骶髓(L6～S1)節(jié)段后固定 4 h,加入 30%蔗糖溶液 4℃過夜。將所取部位橫斷面冷凍切片(40μm)、間斷集片,經(jīng)PBS洗片后行 SABC免疫組織化學(xué)顯色。步驟:正常血清室溫孵育切片 30 min、1∶2 000多克隆 SERT抗體 4℃孵育48 h、1∶500生物素化二抗室溫孵育 2 h、1∶500鏈霉親和素-過氧化物酶復(fù)合物室溫孵育1 h、DAB顯色 5min;常規(guī)梯度脫水、透明、封片。陰性對照實(shí)驗(yàn)以PBS替代一抗。切片以 HPIAS-1000彩色病理圖文分析系統(tǒng)測量各月齡組大鼠灰質(zhì)后連合(dorsal grey commissure,DGC)、中間外側(cè)核(intermediolateral nucleus,IML)、前角運(yùn)動核(VH)、背外側(cè)核(dorsal lateral nucleus,DLN)、球海綿體肌脊髓核(spinal nucleus of the bulbocavernosus,SNB)和骶副交感核(sacral parasympathetic nucleus,SPN)SERT免疫反應(yīng)強(qiáng)度的灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)以x±s表示,經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后行成組設(shè)計(jì)的 t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腰骶髓排尿相關(guān)核團(tuán)SERT免疫組化 脊髓腰骶部排尿相關(guān)核團(tuán)含有較豐富的 SERT免疫陽性纖維及膨體,點(diǎn)狀的免疫反應(yīng)膨體分布于核團(tuán)神經(jīng)元胞體周圍。兩組大鼠核團(tuán)SERT免疫陽性纖維和膨體的分布方式未見明顯區(qū)別,但免疫反應(yīng)強(qiáng)度在兩組存在顯著差異,24月齡組 SERT免疫陽性纖維及膨體在 DGC、IML、VH、DLN和 SNB少于 3月齡組。見圖 1。

2.2 衰老對大鼠腰骶髓排尿相關(guān)核團(tuán)SERT免疫反應(yīng)強(qiáng)度的影響 與 3月齡組比較,24月齡組所觀察的部分核團(tuán)SERT免疫反應(yīng)陽性纖維和膨體的灰度值顯著增加;在 DGC升高了13.3%;IML、VH、DLN和 SNB分別升高了 10.7%、8.3%、12.4%和 5%。兩組 SPN處SERT免疫反應(yīng)陽性纖維和膨體的灰度值無顯著差異,僅存在升高的趨勢。見表 1。

圖1 大鼠腰骶髓排尿相關(guān)核團(tuán)SERT免疫組織化學(xué)顯色(×40)

表1 衰老對大鼠腰骶髓排尿相關(guān)核團(tuán)SERT免疫反應(yīng)強(qiáng)度的影響(x±s)

3 討 論

SERT是位于 5-HT能神經(jīng)末梢的一種膜蛋白,從突觸間隙中重?cái)z取 5-HT入突觸前末梢,從而調(diào)節(jié) 5-HT的作用強(qiáng)度和時間,其表達(dá)變化直接影響 5-HT能神經(jīng)元參與的神經(jīng)活動。研究表明,SERT比 5-HT更能準(zhǔn)確反映腦內(nèi) 5-HT能神經(jīng)體系的變化〔7〕。本研究顯示,DGC、IML、VH、DLN和 SNB的 SERT免疫反應(yīng)陽性纖維和膨體顯著減少,SPN處雖無顯著差異,但也存在降低趨勢。利用 SPECT/PET方法顯示老年人腦中縫背核SERT配基結(jié)合信號減少的結(jié)果〔8〕支持本研究結(jié)果。以往運(yùn)用高效液相色譜分析法(HPLC)的研究雖未見腰骶髓 5-HT的年齡變化,但觀察到 5-HT代謝產(chǎn)物 5-HIAA(五羥吲哚乙酸)水平的改變〔9〕,與本研究觀察結(jié)果的差異很可能與用于 HPLC檢測的脊髓組織不僅含有灰質(zhì),還含有白質(zhì)干擾了結(jié)果分析有關(guān)。

腰骶髓排尿相關(guān)核團(tuán)在維持下尿路正常的儲存和排尿這兩個功能上起著十分重要的作用,大鼠脊髓的 SNB和DLN與人 Onuf核相似,兩核團(tuán)的運(yùn)動神經(jīng)元發(fā)出纖維通過陰部神經(jīng)支配尿道外括約肌或盆底肌群;腰 1～腰 2節(jié)段 IML、DGC的交感節(jié)前神經(jīng)元以及 SPN的副交感節(jié)前神經(jīng)元通過投射到相應(yīng)的節(jié)后神經(jīng)元而支配膀胱和尿道的平滑肌;而腰 5～骶 1節(jié)段DGC的部分中間神經(jīng)元可能參與調(diào)控支配膀胱平滑肌的副交感節(jié)前神經(jīng)元的活動〔10～12〕。老年大鼠腰骶髓這些核團(tuán) 5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體免疫反應(yīng)陽性纖維和膨體的減少提示,5-HT能神經(jīng)纖維對腰骶髓排尿相關(guān)核團(tuán)神經(jīng)元支配的減弱,這很可能與老年排尿障礙有關(guān),但其詳細(xì)機(jī)制還有待進(jìn)一步探究。

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