(雀巢研發(fā)中心上海有限公司，上海 201812)

雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌等被稱為益生菌，近幾年來一直受到廣泛的關(guān)注。大量發(fā)酵和未經(jīng)發(fā)酵的奶制品，如牛奶、酸奶、冰淇淋和奶酪等都可以為人體提供這種有益菌。但同時(shí)，由于它們對(duì)生存環(huán)境有著極高的要求(極度厭氧環(huán)境下生長(zhǎng)和抗酸性環(huán)境能力差)，很難在產(chǎn)品中保持較高的活菌數(shù)。因此，目前的研究更多地關(guān)注于在不適合的生長(zhǎng)環(huán)境下益生菌的表現(xiàn)，以拓寬益生菌在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用并降低生產(chǎn)過程中的成本。

當(dāng)有大量活菌存在時(shí)，益生菌具有抑制Clostridiumperfringens、Salmonellatyphimurium、Listeriamonocytogenes、Campylobacterjejuni、Bacteroidesvulgatus和Escherichiacoli等致病菌的作用，許多研究認(rèn)為這是由于其自身代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸、過氧化氫、抗菌素和其它抑菌成分所造成的[1]。大腸埃希菌O157:H7是非常常見的食源性致病菌，受感染的人會(huì)有嚴(yán)重的腹瀉、腹痛和發(fā)燒等癥狀。鑒于它極強(qiáng)的致病性(尤其是對(duì)青少年和老年人)和生存能力，在食品中是不能檢出的[2]。

雖然研究已經(jīng)證實(shí)了益生菌對(duì)大腸埃希菌O157:H7的抑制作用，但是它們都強(qiáng)調(diào)了大量活菌數(shù)和厭氧條件(尤其對(duì)雙歧桿菌)的必要性。而對(duì)于益生菌(主要是雙歧桿菌)在有氧條件下對(duì)于大腸埃希菌O157:H7的影響卻很少涉及。因此，本研究旨在了解益生菌混合物在利于大腸埃希菌O157:H7生長(zhǎng)的條件(37℃， 有氧)下對(duì)該致病菌的影響，具體考察培養(yǎng)基的pH值和益生菌(主要是雙歧桿菌)有氧狀態(tài)下的代謝產(chǎn)物在其中所起到的作用。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌株

5株益生菌：Bifidobacteriumlactis/animalis、B.bifidum、B.longum、Lactobacillusacidophilus，Chr.Hansen 。大腸埃希菌(Escherichiacoli)O157:H7(ATCC 43890) 由Juan L.Silva(Mississippi State University, MS, USA) 博士提供。

1.2 細(xì)菌細(xì)胞的處理

所有菌株都在含有50%甘油和11%脫脂牛奶的凍藏管中-80℃下儲(chǔ)藏。益生菌在MRS肉湯(Becton Dickinson, Sparks, MD, USA)中，37℃、厭氧條件下復(fù)活和復(fù)壯[3]。大腸埃希菌O157:H7在TSB肉湯(Becton Dickinson)中，37℃、有氧條件下復(fù)活復(fù)壯[4]。每次實(shí)驗(yàn)之前菌株都必須經(jīng)過12 h的培養(yǎng)，然后用0.85%的鹽水離心(1000 g，4℃, 2 min)清洗2次。在0 h、4 h(快速生長(zhǎng)階段)、8 h(平穩(wěn)生長(zhǎng)階段)和24 h取樣，使用TSA(Becton Dickinson)平板來記錄大腸埃希菌O157:H7的活菌數(shù)(log CFU·mL-1)。

1.3 益生菌對(duì)大腸埃希菌O157:H7生長(zhǎng)的抑制作用的研究

將益生菌混合物(5株)和10 μL大腸埃希菌O157:H7分別接入10 mL 11%的脫脂牛奶和MRS肉湯中，在37℃、 100 r·min-1振蕩(C24型溫控?fù)u床)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)過程中監(jiān)控大腸埃希菌O157:H7的活菌總數(shù)和培養(yǎng)基的pH值。

1.4 低pH值環(huán)境對(duì)大腸埃希菌O157:H7生長(zhǎng)的影響研究

將10 μL大腸埃希菌O157:H7分別接入用1 mol·L-1氫氧化鈉調(diào)酸的11%脫脂牛奶(pH值3.8)和MRS肉湯(pH值3.9)中[5]，在37℃、 100 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h。和在未經(jīng)調(diào)酸的11%脫脂牛奶(pH值6.4)和MRS肉湯(pH值6.5)中培養(yǎng)生長(zhǎng)情況比較。

1.5 益生菌對(duì)經(jīng)過酸適應(yīng)的大腸埃希菌O157:H7抑制作用的研究

將大腸埃希菌O157:H7接入1 mL TSB肉湯(多加入10 g·L-1葡萄糖，用1 mol·L-1氫氧化鈉調(diào)pH值至4.8)，在37℃、100 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h，得到經(jīng)過酸性環(huán)境適應(yīng)的酸適應(yīng)大腸埃希菌O157:H7，用0.85%鹽水離心(1000 g，4℃, 2 min)清洗2次，然后取10 μL和益生菌混合物一起接入11%脫脂牛奶中，在37℃、 100 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h。以10 μL酸適應(yīng)大腸埃希菌O157:H7直接接入11%脫脂牛奶中在37℃、100 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h作為參照，比較大腸埃希菌O157:H7的生長(zhǎng)情況。

1.6 益生菌在有氧狀態(tài)下的代謝產(chǎn)物對(duì)大腸埃希菌O157:H7抑制作用的研究

益生菌混合物接入新鮮的MRS肉湯中，在37℃、100 r·min-1振蕩培養(yǎng)8 h，離心(30 000 g，4℃, 20 min)，用0.22 μm的濾紙抽真空過濾得到無菌的澄清液，將澄清液分成兩份，其中一份用6 mol·L-1氫氧化鈉調(diào)pH值至6.5(新鮮MRS肉湯的pH值)。10 μL大腸埃希菌O157:H7被分別接入這兩份澄清液中，然后在37℃、100 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h[6]。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，得到平均值和標(biāo)準(zhǔn)方差。用Fisher的LSD(Least significance difference)實(shí)驗(yàn)判斷方法判斷樣品之間是否有顯著差異(P≤0.05)(SAS 9.0版本; SAS, 2004)。

2 結(jié)果與討論

2.1 益生菌對(duì)大腸埃希菌O157:H7生長(zhǎng)的抑制作用(表1、圖1)

表1 有氧狀態(tài)下益生菌在11%脫脂牛奶和MRS肉湯中對(duì)大腸埃希菌O157:H7的抑制作用(n=3)

圖1 有氧條件下益生菌混合物和大腸埃希菌O157:H7在MRS肉湯中培養(yǎng)時(shí)，大腸埃希菌O157:H7的生長(zhǎng)(a)和MRS肉湯pH值(b)的變化情況(n=3)

由表1可知，沒有加益生菌的脫脂牛奶中，大腸埃希菌O157:H7經(jīng)過8 h培養(yǎng)，總菌數(shù)從約6 log CFU·mL-1增加到了約8 log CFU·mL-1。而加了益生菌的脫脂牛奶中，總菌數(shù)從約6 log CFU·mL-1降低到了約1 log CFU·mL-1。由于MRS肉湯適于益生菌的生長(zhǎng)，所以用MRS肉湯為培養(yǎng)基，重復(fù)了以上的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果極為相似:在加了益生菌的MRS肉湯中，大腸埃希菌O157:H7經(jīng)過8 h培養(yǎng)，總菌數(shù)達(dá)到了不可檢出。從以上結(jié)果可以看出，無論活菌的含量多少，益生菌對(duì)大腸埃希菌O157:H7的生存生長(zhǎng)起著抑制的作用。

由圖1可知，大腸埃希菌O157:H7在加了益生菌的MRS肉湯中培養(yǎng)8 h時(shí)已經(jīng)不可檢出，因此，將MRS肉湯在第8 h的pH值作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中調(diào)整培養(yǎng)基pH值的標(biāo)準(zhǔn)，用來研究低pH值環(huán)境對(duì)大腸埃希菌O157:H7生長(zhǎng)的影響，而8 h也作為益生菌在MRS肉湯里有氧條件下的培養(yǎng)時(shí)間，以便研究益生菌在有氧狀態(tài)下代謝產(chǎn)物對(duì)大腸埃希菌O157:H7生長(zhǎng)的影響。

2.2 低pH值環(huán)境對(duì)大腸埃希菌O157:H7生長(zhǎng)的影響(圖2)

圖2 大腸埃希菌O157:H7在酸性環(huán)境和在益生菌共存的有氧環(huán)境中的生長(zhǎng)情況(n=3)

由圖2可知，低pH值環(huán)境和益生菌混合物均對(duì)大腸埃希菌O157:H7的生長(zhǎng)有抑制作用。資料顯示大腸埃希菌O157:H7能夠存活的最低pH值在4.0～4.5之間[7]，本次實(shí)驗(yàn)得到了類似的結(jié)果，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，益生菌混合物對(duì)大腸埃希菌O157:H7的抑制作用比低pH值環(huán)境更為迅速。

2.3 益生菌對(duì)經(jīng)酸適應(yīng)的大腸埃希菌O157:H7的抑制作用(圖3)

圖3 酸適應(yīng)和未經(jīng)酸適應(yīng)的大腸埃希菌O157:H7在和益生菌共存的11%脫脂牛奶中有氧狀態(tài)下的生長(zhǎng)情況(n=3)

經(jīng)過酸適應(yīng)的大腸埃希菌O157:H7在低pH值環(huán)境下?lián)碛懈鼜?qiáng)的存活能力[8]，同時(shí)抵抗其它環(huán)境壓力的能力也更高于未經(jīng)酸適應(yīng)的大腸埃希菌O157:H7[9]。因此經(jīng)酸適應(yīng)的大腸埃希菌O157:H7和益生菌混合物一起被接入11%的脫脂牛奶中，在37℃、100 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3)顯示經(jīng)酸適應(yīng)的大腸埃希菌O157:H7在抵抗益生菌方面的能力并沒有提高。

2.4 益生菌在有氧狀態(tài)下的代謝產(chǎn)物對(duì)大腸埃希菌O157:H7的抑制作用(圖4)

圖4 低pH值環(huán)境和益生菌有氧狀態(tài)下的代謝產(chǎn)物對(duì)大腸埃希菌O157:H7的抑制作用(n=3)

由圖4可知，將澄清液的pH值調(diào)回6.5(新鮮MRS肉湯的pH值)，大腸埃希菌O157:H7生長(zhǎng)較好，這表明低pH值是抑制其生長(zhǎng)的最主要因素，同時(shí)也證明了益生菌的酸類代謝產(chǎn)物(如乙酸)[10]降低了環(huán)境的pH值從而達(dá)到了抑制大腸埃希菌O157:H7生長(zhǎng)的目的。并且，由于大腸埃希菌O157:H7在pH值4.4的澄清液中死亡速度反而比在pH值3.9的新鮮MRS肉湯中更快，表明益生菌在有氧狀態(tài)下的其它代謝產(chǎn)物也同時(shí)對(duì)大腸埃希菌O157:H7的死亡起著推進(jìn)作用。

許多研究支持了這個(gè)假設(shè):雙歧桿菌B.longum的代謝產(chǎn)物被報(bào)道具有阻礙大腸埃希菌O157:H7吸附腸道上皮細(xì)胞的功能[11]；益生菌在有氧狀態(tài)下的代謝產(chǎn)物的組成可能與益生菌含有6-磷酸果糖磷酸酮酶有關(guān)。該酶能將葡萄糖轉(zhuǎn)化為醋酸和乳酸，同時(shí)也能將氧氣轉(zhuǎn)化為許多不同的物質(zhì)(如超氧和過氧化氫)，從而導(dǎo)致了雙歧桿菌不能在有氧狀態(tài)下存活[12]。醋酸、乙酸和過氧化氫都有抑制大腸埃希菌O157:H7的作用[13]，而這三種物質(zhì)也能被氫氧化鈉在調(diào)整pH值時(shí)中和。因此這三種物質(zhì)是最有可能在澄清液中造成大腸埃希菌O157:H7死亡的主要原因之一。以上假設(shè)需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行論證。

3 結(jié)論

益生菌混合物(5株)在11%脫脂牛奶和MRS肉湯中對(duì)大腸埃希菌O157:H7的生存生長(zhǎng)有抑制作用。酸性環(huán)境是阻礙大腸埃希菌O157:H7生存生長(zhǎng)的主要原因之一。而益生菌在有氧狀態(tài)下的代謝產(chǎn)物是加速大腸埃希菌O157:H7死亡的另一個(gè)主要原因，這些代謝產(chǎn)物有可能被氫氧化鈉中和或者是在低酸性環(huán)境下失去作用。需要用進(jìn)一步的研究來確定這些代謝產(chǎn)物的組成和成分。

參考文獻(xiàn)：

[1] Leahy S C， Higgins D G,Fitzgerald G F,et al.Getting better with bifidobacteria[J]. J Appl Microbiol,2005,98(6):1303-1315.

[2] Centers for Disease Control and Prevention(CDC) [EB]. 2006.EscherichiacoliO157:H7. http://www.cdc.gov/ncidod/dbmd/diseaseinfo/escherichiacoli_g.htm.

[3] De Man J C, Rogosa M,Sharpe M E. A medium for the cultivation ofLactobacilli[J]. J Appl Micro,1960,23(1): 130-135.

[4] Gagnon M， Kheadr E E，Le Blay G, et al.Invitroinhibition ofEscherichiacoliO157:H7 by bifidobacterial strains of human origin[J]. Int J Food Microbiol,2004, 92(1): 69-78.

[5] Dave R I， Shan N P. Evaluation of media for selective enumeration ofStreptococcusthermophilus,Lactobacillusdelbrueckiispp.bulgaricus,Lactobacillusacidophilus, and bifidobacteria[J]. J Dairy Sci, 1996,79: 1529-1536.

[6] Yamamoto Y， Togawa Y, Shimosaka M, et al. Purification and characterization of a novel bacteriocin produced byEnterococcusfaecalisstrain RJ-11[J]. Appl Environ Microbiol， 2003,69(10): 5746-5753.

[7] Buchanan R L,Bagi L K. Expansion of response surface models for the growth ofEscherichiacoliO157:H7 to include sodium nitrite as a variable[J]. Int J Food Microbiol, 1994,23(3-4): 317-332.

[8] Cheng H Y， Yang H Y,Chou C C.Influence of acid adaptation on the tolerance ofEscherichiacoliO157:H7 to some subsequent stresses[J]. J Food Prot, 2002,65(2): 260-265.

[9] Rowbury R J.An assessment of environmental factors influencing acid tolerance and sensitivity inEscherichiacoli,Salmonellaspp. and other enterobacteria[J]. Lett Appl Microbiol, 1995,20(6): 333-337.

[10] Asahara T, Shimizu K, Nomoto K, et al. Probiotic bifidobacteria protect mice from lethal infection with Shiga toxin-producingEscherichiacoliO157:H7[J]. Infec Immun, 2004, 72(4): 2240-2247.

[11] Kim S H， Yang S J, Koo H C, et al. Inhibitory activity ofBifidobacteriumlongumHY8001 againstVerocytotoxinofEscherichiacoliO157:H7[J]. J Food Prot, 2001, 64(11): 1667-1673.

[12] Tamine A Y， Marshall V M, Robinson R K. Microbiological and technological aspects of milks fermented by bifidobacteria[J]. J Dairy Res, 1995,62(1): 151-187.

[13] Ouwehand A C， Vesterlund S. Antimicrobial Components from Lactic Acid Bacteria(3rd ed)[M]. New York: Marcel Dekker Inc, 2004:375-389.