劉朝圣 曾 順

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué),長沙410208 2.湖南省瀏陽市中醫(yī)院

男性生殖健康的關(guān)鍵問題是精子質(zhì)量?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,附睪對精子的成熟、儲(chǔ)運(yùn)與衰變處理都有十分重要的影響。附睪是精子成熟的管內(nèi)環(huán)境,其分泌參與精子成熟的因子有肉毒堿、α-糖苷酶、甘油-3-磷酸膽堿(GPC)及唾液酸(SA),在精子的成熟、獲能、精卵識(shí)別及受精等過程中起著重要作用,它們反映了附睪的重要功能,是附睪的功能性指標(biāo)。本文通過觀測天蠶壯陽散對腎陽虛證雄性小鼠附睪功能性指標(biāo)精子膜甘油-3-磷酸膽堿的變化,探討溫補(bǔ)腎陽法對雄性小鼠附睪功能影響的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)機(jī)制。

一般資料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:普通級健康雄性昆明種小鼠80只,日齡50天,體質(zhì)量17～22g,室溫 16℃～20℃,濕度 65%～70%,自由飲水進(jìn)食(以上均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。

藥液制備:天蠶壯陽散由雄天蠶、熟地黃、枸杞子按10∶8∶7的比例組成。由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房按上述比例購取生藥材250g,先加蒸餾水浸泡40min,一煎加藥材量的 6倍水,沸騰后煎30min;二煎加藥材量的4倍水,沸騰后煎20min,過濾,兩煎所得濾液混合后干燥濃縮至1∶1(即1ml藥液相當(dāng)于1g生藥);分裝于500ml廣口試劑瓶中4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑:氫化可的松注射液,批號:20040603;規(guī)格:10mg/2ml;天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司生產(chǎn)。男寶膠囊,批號:20071101;規(guī)格:0.3g/粒:吉林省利華制藥有限公司生產(chǎn),將男寶膠囊用溫開水按1∶10的比例(即1ml藥液含男寶膠囊0.1g)溶成藥液,分裝于500ml廣口試劑瓶中4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)驗(yàn)方法

腎陽虛小鼠模型造模方法[1]:待小鼠適應(yīng)環(huán)境后,從80只小鼠中用隨機(jī)數(shù)字表法抽取20只作為正常組,余下60只作為造模組。造模組均臀部肌肉注射氫化可的松注射液25mg/kg?d,每日 1次,連續(xù)15天。根據(jù)腎陽虛癥狀的客觀指標(biāo)[2]:怕冷、畏寒喜暖、四肢不溫、小便清長、精神委靡、消瘦等確定模型成功與否。

實(shí)驗(yàn)分組:造模成功后將造模組60只小鼠先按體重大小分層,再采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為3組,即天蠶壯陽散治療組(簡稱天蠶組)、男寶治療組(簡稱男寶組)、模型組,每組20只。

給藥方法與藥量:造模成功后開始給藥,正常對照組、模型組經(jīng)灌胃給蒸餾水,天蠶組、男寶組灌胃給相應(yīng)藥物。給藥劑量按動(dòng)物每公斤體重占人體表面積的比值計(jì)算,連續(xù)灌胃 28天,每日 2次,上午 8:30～9:30、下午4:00～5:00各 1次。

精子膜GPC含量的測定:用斷脊法處死小鼠,取出睪丸和附睪組織,仔細(xì)分離后棄去睪丸和附睪外的結(jié)締組織及血管,進(jìn)行組織勻漿,置于恒溫水浴箱中反應(yīng)15min,制作標(biāo)本。按照試劑盒要求操作。取出試劑盒,于室溫20℃～25℃放置15～30min。實(shí)驗(yàn)過程應(yīng)在室溫20℃～25℃內(nèi)進(jìn)行。取出酶標(biāo)板,按照標(biāo)準(zhǔn)品的次序分別加入50μ l的標(biāo)準(zhǔn)品溶液于空白微孔中;空白微孔中加入 50μ l的樣品,空白對照加入 50μ l的蒸餾水;在樣品孔中加入10μ l的生物素溶液(不含空白對照孔);如果樣品確需稀釋,必須是在樣品及生物素混勻的狀態(tài)下,一起等比例稀釋在各孔中加入100μ l的酶標(biāo)記溶液;將酶標(biāo)板用封口膠密封后,37℃孵育反應(yīng)1h(在孵育箱中保持穩(wěn)定的溫度與濕度);充分清洗酶標(biāo)板3～5次,保持各孔有充足的水壓(濃縮洗滌液以1∶100的比例與蒸餾水稀釋);酶標(biāo)板洗滌后用吸水紙徹底拍干;各孔加入顯色劑 A、B液各 50μ l(不含空白對照孔);20℃～25℃下避光反應(yīng) 15min;各孔加入50μ l終止液,終止反應(yīng)。30min內(nèi)在波長450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值;OD值為縱坐標(biāo)(Y軸),以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)(X軸),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖;根據(jù)樣品的OD值查找對應(yīng)的濃度范圍。

結(jié)果

各組精子膜GPC含量變化見表1。

表1 各組精子膜GPC含量變化(±s)

表1 各組精子膜GPC含量變化(±s)

注:與模型組比較,＊P＜0.01;**P＜0.01;△P＜0.05

組別 例數(shù) GPC(μ g∕ml)天蠶組 10 2.93±1.20＊男寶組 10 2.76±1.09＊＊正常組 10 3.24±1.83△模型組 10 4.62±1.27

模型組GPC含量與天蠶組、男寶組比較,差異有顯著性意義(P＜0.01),與正常組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);天蠶組、男寶組及正常組之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

討論

甘油-3-磷酸膽堿(GPC)為一種磷脂類代謝產(chǎn)物,它廣泛存在于哺乳類動(dòng)物的各種組織和器官,尤其是在雄性生殖系統(tǒng)的附睪組織及分泌液中具有相當(dāng)高的含量。國外的一些研究對精漿中GPC濃度進(jìn)行測定后認(rèn)為,精漿GPC濃度與附睪功能密切相關(guān)[3,4]。精子膜GPC對精子在附睪內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的主要作用是作為形成精子膜液態(tài)鑲嵌結(jié)構(gòu)的重要組分,維持膜結(jié)構(gòu)的完整性。精子膜磷脂部分中磷脂酰膽堿(PC)是一種主要成分[5],附睪液中磷脂酶 A又具有較高的活性[6],該酶能分解精子膜上GPC為PC與甘油,而甘油可作為精子代謝過程中的一種能源。精子膜GPC含量越低,精子越趨于成熟,精子活動(dòng)率、活動(dòng)力則趨正常。

中醫(yī)認(rèn)為,男性精液質(zhì)量低下大多屬“腎陽虛”范疇。故溫陽益腎法一直是歷代醫(yī)家用于治療腎陽虛證的主要方法。天蠶壯陽散由雄天蠶、熟地黃、枸杞子等組成。方中以血肉之品雄天蠶(雄蠶蛾中之佳品)為君,以溫腎壯陽,然藥性較之桂、附之類更加平穩(wěn);熟地黃補(bǔ)腎填精;枸杞子補(bǔ)血養(yǎng)肝,蓋因精血同源,氣血充足則腎精化生有源,二者共為臣。全方壯陽與滋陰并舉,其功在于既溫而又不燥,溫腎無燥熱之偏,益精無凝滯之嫌,尤以溫腎陽、益腎精、平衡陰陽見長,使陽得陰助而生化無窮,陰得陽升而泉源不竭,終達(dá)陰陽調(diào)和之效。

本實(shí)驗(yàn)表明,天蠶壯陽散可降低精子膜GPC含量。提示溫腎補(bǔ)陽中藥可通過干擾附睪的生理功能,影響GPC正常分泌,進(jìn)而影響精子在附睪中的成熟,這為天蠶壯陽散治療男性不育提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]陳小野.實(shí)用中醫(yī)證候動(dòng)物模型.北京:北京醫(yī)科大學(xué)、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社,1993:100.

[2]劉福春,李菊仙,丁光霞,等.羥基脲所致小鼠“陽虛”及補(bǔ)陽藥作用的初步研究.中醫(yī)雜志,1985,146(2):67.

[3]Coope r TG,et a1.Epldldyma markers ip human inertility.J Androl,1988,9:91.

[4]Cnsano R,et a1.Simultaneous measurement of seminal L-carnitine,a,1～4glucosidase,andglycerylphosphoryl-choline in azoospermic and oligozoopermic patients.Feitil Steri1,1987,47(2):324.

[5]Hall JC,et a1.Correlation between changes in rat sperm membrane lipids,ptotein,and the membrare physical state during epididymal maturation.J Androl,1991,12(1):76.

[6]Bierve KS,Reitaa LJ.The piesence of an androge controlled phospholipase A in rat epididymis.Int J Aporo(smppl),1978,2:574.