我國(guó)著名生物化學(xué)家吳憲教授早在1931年就首先提出了蛋白質(zhì)變性的概念[1]，作為從分子水平闡明生命奧秘的中心課題之一，蛋白質(zhì)去折疊的研究一直受到生物化學(xué)、生物物理學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域研究工作者的關(guān)注[2,3]。在蛋白質(zhì)變性過程中，維系其空間結(jié)構(gòu)的次級(jí)鍵被破壞，伴隨著焓、熵的顯著變化[4,5]。研究蛋白質(zhì)在不同條件下的變性過程，對(duì)于理解具有一定氨基酸序列結(jié)構(gòu)的多肽鏈如何逐步卷曲形成具有特定空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子具有重要意義[6,7]。

細(xì)胞體系極其復(fù)雜，細(xì)胞內(nèi)含有大量可溶或者不可溶的大分子物質(zhì)，如多糖、蛋白質(zhì)、核酸等，它們以不同的濃度而存在[8～10]，這些不同種類的大分子物質(zhì)占據(jù)了細(xì)胞總體積的20%～30%，大多數(shù)的生命化學(xué)反應(yīng)正是在這種極其擁擠的環(huán)境體系中完成的。 但長(zhǎng)期以來蛋白質(zhì)去折疊的研究均是在簡(jiǎn)單的緩沖體系——稀溶液中進(jìn)行的。簡(jiǎn)單的稀溶液并不能真實(shí)反映胞內(nèi)蛋白質(zhì)的去折疊過程。因此，模擬細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境，盡可能地在接近真實(shí)的細(xì)胞體系中進(jìn)行體外研究十分必要，近幾年已有相關(guān)的報(bào)道[11～15]。一些高分子聚合物，如聚乙二醇(PEG)和葡聚糖等常被用作擁擠試劑模擬細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境，進(jìn)而改善蛋白質(zhì)的生物活性[16～18]或藥物的利用程度[19]。

作者以PEG2000、PEG4000、PEG6000、PEG20 000作為擁擠試劑，利用DSC研究了聚乙二醇對(duì)溶菌酶熱變性過程的影響。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑及儀器

溶菌酶為凍干粉末，Genview公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。實(shí)驗(yàn)用水為去離子蒸餾水，所有試樣溶液均用緩沖溶液配制。

日立U-3310型紫外可見分光光度計(jì)，Hitachi公司；Micro-DSCⅢ型微量熱儀,法國(guó)Setaram公司。

1.2 方法

將溶菌酶溶于不同質(zhì)量濃度(0～350 g·L-1)的PEG溶液中，酶的濃度均為0.5 mmol·L-1。用微量熱儀記錄各樣品的熱轉(zhuǎn)變曲線，儀器工作溫度范圍253～393 K，溫度精確度10-4K，熱流精度10-4mW，升溫速率在0.01～1.2 K·min-1范圍內(nèi)無級(jí)可調(diào)。實(shí)驗(yàn)設(shè)定升溫速率為0.15 K·min-1。實(shí)驗(yàn)取Tm為變性溫度，ΔH為變性焓。

酶濃度通過用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定280 nm下的吸光度值而計(jì)算得到。

2 結(jié)果與討論

2.1 聚乙二醇對(duì)溶菌酶變性溫度的影響

分別考察了不同濃度PEG2000、PEG4000、PEG6000、PEG20 000對(duì)溶菌酶熱變性時(shí)變性溫度Tm的影響，結(jié)果見表1。

表1 溶菌酶在不同PEG及濃度下的變性溫度

由表1可以看出，熱變性時(shí)溶菌酶的變性溫度Tm隨著PEG質(zhì)量濃度的增加而降低，且Tm值與PEG的分子質(zhì)量息息相關(guān)。當(dāng)用PEG2000作為擁擠試劑時(shí)，其Tm值變化最大，由350.35 K降至343.75 K；當(dāng)用PEG20 000作為擁擠試劑時(shí)，其Tm值變化最小，由350.35 K降至345.45 K。在同一質(zhì)量濃度下，溶菌酶的Tm與PEG的分子質(zhì)量成正比關(guān)系，即PEG的分子質(zhì)量越大，變性溫度Tm越高。對(duì)于同一分子質(zhì)量的PEG 來說，變性溫度Tm與PEG的質(zhì)量濃度(c)基本呈線性關(guān)系，且線性度較好，R2值均大于0.9910。

PEG2000：Tm=-0.1842c+350.019R2=0.9926

PEG4000：Tm=-0.1670c+350.064R2=0.9910

PEG6000：Tm=-0.1535c+350.200R2=0.9950

PEG20 000：Tm=-0.1316c+350.284R2=0.9946

2.2 聚乙二醇對(duì)溶菌酶變性焓的影響

分別考察了不同濃度PEG2000、PEG4000、PEG6000、PEG20 000對(duì)溶菌酶熱變性時(shí)變性焓ΔH的影響，結(jié)果如表2所示。

由表2可以看出,整個(gè)實(shí)驗(yàn)中PEG的分子質(zhì)量及質(zhì)量濃度對(duì)變性焓ΔH的影響較小，ΔH維持在(515.95±28.75) kJ·mol-1之間，基本為一定值。

3 結(jié)論

探討了擁劑試劑PEG及濃度對(duì)溶菌酶熱變性過程的影響。結(jié)果表明，變性溫度Tm隨著PEG質(zhì)量濃度的增加而降低，且基本呈線性關(guān)系。在同一質(zhì)量濃度下，Tm的大小與PEG的分子質(zhì)量成正比關(guān)系，即PEG的分子質(zhì)量越大，變性溫度Tm越高。整個(gè)實(shí)驗(yàn)中PEG的分子質(zhì)量及質(zhì)量濃度對(duì)變性焓ΔH的影響較小，ΔH維持在(515.95±28.75) kJ·mol-1之間，基本為一定值。

表2 溶菌酶在不同PEG及濃度下的變性焓

參考文獻(xiàn)：

[1] Wu H.Studies on denaturation of proteins..A theory of denaturation[J].Chin J Chem,1931,5:321-344.

[2] Baker T A.Protein unfolding.Trapped in the act[J].Nature,1999,401(6748):29-30.

[3] Makhatadze G I.Thermodynamics of protein interactions with urea and guanidinium hydrochloride[J].J Phys Chem B,1999,103(23):4781-4785.

[4] 方盈盈,胡新根,于麗,等.溶菌酶熱變性的DSC研究[J].物理化學(xué)學(xué)報(bào),2007,23(1):84-87.

[5] Murphy K P,Bhakuni V,Xie D,et al.Molecular basis of co-operactivity in protein folding.Ⅲ.Structural identification of cooperative folding units and folding intermediates[J].J Mol Biol,1992,227(1):293-306.

[6] Michnik A,Drzazga Z,Kluczewska A,et al.Differential scanning microcalorimetry study of the thermal denaturation of haemoglobin[J].Biophys Chem,2005,118(2-3):93-101.

[7] 商志才,易平貴,俞慶森,等.環(huán)丙沙星與牛血清白蛋白的結(jié)合反應(yīng)[J].物理化學(xué)學(xué)報(bào),2001,17(1):48-52.

[8] Dogan J,Lendel C,H?rd T.Thermodynamics of folding and binding in an affibody:Affibody complex[J].J Mol Biol,2006,359 (5):1305-1315.

[9] Nasrollah R G,Azadeh E H,Mohsen N G.Effect of polyamines on the structure,thermal stability and 2,2,2-trifluoroethanol-induced aggregation ofα-chymotrypsin[J].Int J Biol Macromol,2007,41(5):597-604.

[10] Salvetti G,Tombari E.The endothermic effects during denaturation of lysozyme by temperature modulated calorimetry and an intermediate reaction equilibrium[J].J Phys Chem B,2002,106 (23):6081-6087.

[11] Ellis R J,Minton A P.Cell biology:Join the crowd[J].Nature,2003,425(6953):27-28.

[12] Jiang M,Guo Z H.Effects of macromolecular crowding on the intrinsic catalytic efficiency and structure of enterobactin-specific isochorismate synthase[J]. J Am Chem Soc,2007,129(4):730-731.

[13] Michael P,Loren S,Pernilia W S.Macromolecular crowding increases structural content of folded proteins[J]. FEBS Lett,2007,581(26):5065-5069.

[14] Du F,Zhou Z,Liang Y.Mixed macromolecular crowding accelerates the refolding of rabbit muscle creatine kinase:Implications for protein folding in physiological environments[J]. J Mol Biol,2006,364(3):469-482.

[15] Maria T M Z,Alejandro M V,Francisco J M,et al.EscherichiacoliAspP activity is enhanced by macromolecular crowding and by both glucose-1,6-bisphosphate and nucleotide-sugars[J]. FEBS Lett,2007,581(5):1035-1040.

[16] Middaugh C R,Tisel W A,Haier R N,et al.Determination of the apparent thermodynamic activities of saturated protein solutions[J].J Biol Chem,1978,254(2):367-370.

[17] Laurent T C.Enzyme reactions in polymer media[J].Eur J Biochem,1971,21(4):498-506.

[18] Harris J M.Poly(ethylene glycol) Chemistry:Biotechnical and Biomedical Applications[M].New York:Plenum Press,1992:11-12.

[19] Verheyen S,Blaton N,Kingrt R,et al.Pharmaceutical performance of solid dispersions containing poly (ethylene glycol) 6000 and diazepam or temazepam[J].J Therm Anal Cal,2004,76(2):405-416.