非水反相色譜法測定球蟲感染后三黃雞血清中類胡蘿卜素的含量

王德圣 李永勝 趙 劍

自然界中已發(fā)現(xiàn)的類胡蘿卜素有600種，都可以看作是從β-胡蘿卜素衍生而來的。但只有很少一部分類胡蘿卜素能有效的沉積在禽體內(nèi)。

類胡蘿卜素從吸收入血液到沉積到相關(guān)部位受到很多因素的影響，其中疾病的感染最為嚴(yán)重。Ruff等（1974）報道了雞在常見的6種球蟲感染后，血清中類胡蘿卜素含量在感染后的6～8 d都明顯下降；Koutsos等（2003）報道了注射LPS或IL-1引起的血漿中類胡蘿卜素含量發(fā)生變化。血液類胡蘿卜素含量對疾病感染的敏感性引起了研究者的興趣，而準(zhǔn)確測定血液中類胡蘿卜素含量的方法還有待完善。另外，測定血液中類胡蘿卜素含量有利于真實(shí)準(zhǔn)確地反映其生物學(xué)利用率，從而取代依靠飼料類胡蘿卜素含量與產(chǎn)品色澤相關(guān)關(guān)系這一粗放的評價指標(biāo)。

高效液相色譜法是近10年來應(yīng)用最普遍的定性、定量檢測血液中類胡蘿卜素含量的方法。Waysek提出了以正相色譜法分離類胡蘿卜素的標(biāo)準(zhǔn)，但是柱填料硅膠會促進(jìn)類胡蘿卜素的分解。采用常規(guī)反相色譜由于流動相中含有一定量水，導(dǎo)致洗脫類胡蘿卜素這類非極性組分的峰型不對稱，甚至還會發(fā)生組分的柱上沉淀。非水反相色譜法被認(rèn)為是當(dāng)前測定生物組織類胡蘿卜素含量最好的方法（Su等，2002；Furr，2004），但這類研究以人血液為樣本，分離的結(jié)果中沒有出現(xiàn)對角黃素（Canthaxanthin）和Apo類胡蘿卜素酯（Apo-Carotenioc ester）的特征描述，而這恰是家禽飼料中應(yīng)用最多的兩種色素成分。

本實(shí)驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，建立了一種非水反相液相高效色譜測定血液中角黃素和Apo類胡蘿卜素酯的分析方法，并比較了在堆型或柔嫩艾美爾球蟲感染下血清中這兩種物質(zhì)的變化。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要設(shè)備和試劑

Waters2690高效液相色譜儀，Nova-Pak C18色譜柱（300 mm×3.9 mm ID，5 μm），UV-100紫外可見光檢測器，Sigma-2K15型低溫高速離心機(jī)，IKA-MS1型旋渦混勻機(jī)，KQ-250B型超聲波清洗機(jī)。

甲醇、乙腈和四氫呋喃均為色譜純，無水乙醇、正己烷和抗壞血酸為分析純。角黃素和Apo類胡蘿卜素酯標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司，純度96%。

分別精確稱取0.0040 g的角黃素和Apo類胡蘿卜素酯標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇：乙腈：四氫呋喃為75：20：5混合液定容到 100 ml制成儲備液（40 μg/ml），再分別稀釋制成 2、4、6、8、10 μg/ml用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定。

1.2 樣品的采集和制備

1.2.1 樣品采集

144只三黃雞平均分成A、B、C 3組。飼料按NRC家禽營養(yǎng)需要標(biāo)準(zhǔn)配制，角黃素和Apo類胡蘿卜素酯在 0～21、22～29、30～42 日齡的飼料中添加量分別是30、35、19.5 mg/kg 和 15、25、14 mg/kg。在第 21 日齡時，B組每羽嗉囊接種3×104個堆型艾美爾球蟲孢子化卵囊；C組每羽嗉囊接種1.5×104個柔嫩艾美爾球蟲孢子化卵囊；A組作為對照組。分別在感染后的第0、7、14 d每組選6只雞各抽取2 ml血液，自然凝固后在4℃下5000 r/min離心15 min，收集血清，保存在-30℃冰箱備用。

1.2.2 樣品制備

用移液槍精確吸取100 μl血清樣品置于5 ml聚乙烯離心管中，加入100 μl無水乙醇后振蕩，再加入1 ml正己烷，2000 r/min旋渦混勻1.5 min，然后在4℃下15000 r/min離心3 min后用移液槍收集上清液。將離心管中的沉淀破碎后再加入1 ml正己烷，超聲水浴3 min后取出，重復(fù)上述旋渦混勻和離心過程。將兩次的上清液合并后加入0.5 ml雙蒸水，重復(fù)上述旋渦混勻和離心過程，之后用移液槍精確吸取0.5 ml正己烷相置1 ml聚乙烯離心管中，氮?dú)獯蹈珊笥?00 μl流動相溶解。制成的樣品密封后放置于-30℃冰箱中避光保存，8 h內(nèi)過色譜儀測定。

1.3 色譜條件

流動相為甲醇：乙腈：四氫呋喃按照75：20：5（v： v： v）配制，然后加 0.05%（w： v）抗壞血酸。流速為1.0 ml/min，檢測器檢測波長450 nm，壓力30 bar，柱溫 20 ℃，進(jìn)樣量 20 μl。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特征和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別取2種類胡蘿卜素各濃度的標(biāo)準(zhǔn)液20 μl依次進(jìn)樣。記錄出峰時間和出峰面積，計算每種物質(zhì)的平均出峰時間，用外標(biāo)峰面積法測定線性關(guān)系。

角黃素和Apo類胡蘿卜素酯標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖見圖1。

圖1 黃體素、角黃素和Apo類胡蘿卜素酯標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖

在本實(shí)驗(yàn)條件下，角黃素和Apo類胡蘿卜素酯的保留時間分別是：（4.69±0.04）min 和（5.72±0.10）min（n=5）。

以各類胡蘿卜素的質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積為橫坐標(biāo)繪制2條標(biāo)準(zhǔn)曲線：角黃素，Y=5×10-6X-0.3169（R2=0.9924）；Apo 類胡蘿卜素酯，Y=3×10-6X-0.2325（R2=0.9991）。

2.2 回收率實(shí)驗(yàn)

采用加標(biāo)回收法。取同一樣品0.7 ml均分成7份，其中6份加入已知量的角黃素和Apo類胡蘿卜素酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，另1份作為對照。按1.2節(jié)中樣品制備方法進(jìn)行處理，色譜測定的結(jié)果見表1。

2.3 樣品色譜分離情況（見圖2）

表1 方法回收率（n=6）

圖2 血清樣品中類胡蘿卜素的色譜圖

圖2為血清樣品中類胡蘿卜素的色譜圖。在本實(shí)驗(yàn)選定的分離條件下，雞血清樣品可分離出4種物質(zhì)。對照圖1可見，血清樣品中的角黃素和Apo類胡蘿卜素酯有著各自明顯的特征峰，得到了很好的分離。血清樣品中最早分離出的物質(zhì)（t保留=4.07±0.01）與黃體素（Lutein）在本實(shí)驗(yàn)條件的保留時間一致（見圖1）。

2.4 不同球蟲感染后血清中類胡蘿卜素的變化

采用本實(shí)驗(yàn)方法測定雞球蟲感染后第0、7和14 d血清中角黃素和Apo類胡蘿卜素酯的含量，結(jié)果見表2和圖3。從表2、圖3可見，當(dāng)飼料中添加量減少，血清中該類胡蘿卜素的含量呈現(xiàn)出相應(yīng)的變化。球蟲感染后，血清中的角黃素和Apo類胡蘿卜素酯水平都出現(xiàn)了顯著的下降趨勢，但出現(xiàn)的時間在不同球蟲感染中相差很大。

表2 不同球蟲感染后不同時間血清角黃素和Apo類胡蘿卜素酯的含量（μg/ml）

圖3 球蟲感染后2周雞血清中角黃素和Apo類胡蘿卜素酯含量變化曲線

3 分析和討論

3.1 實(shí)驗(yàn)方法評估

3.1.1 方法學(xué)對回收率的要求在95%～105%，但有些方法操作步驟繁復(fù)，可要求在90%～110%。而相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），一般要求應(yīng)根據(jù)樣品含量高低和含量測定方法的繁簡確定，如含量很低一般不大于5%；含量較高的，則應(yīng)從嚴(yán)要求。

本實(shí)驗(yàn)建立的測定方法對角黃素和Apo類胡蘿卜素酯的回收率分別是99.7%和102.0%，RSD分別為5.25%和4.28%，符合方法學(xué)的要求。

3.1.2 雞血清樣品在本實(shí)驗(yàn)中分離出4種物質(zhì)，其中1、3和4號物質(zhì)通過與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的比較可以確定依次是黃體素、角黃素和Apo類胡蘿卜素酯。Barua（1992）使用與本實(shí)驗(yàn)相近的方法在人血清中也分離出1號和2號物質(zhì)，并認(rèn)為2號物質(zhì)為玉米黃質(zhì)（Zeaxanthin）。黃體素和玉米黃質(zhì)都是玉米、玉米蛋白粉中主要的類胡蘿卜素，二者是位置異構(gòu)體（見圖4）。色譜分析結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)條件下還不能很好的分離這樣的異構(gòu)物質(zhì)。

圖4 黃體素（Lutein）和玉米黃質(zhì)（Zeaxanthin）的結(jié)構(gòu)式

3.2 球蟲感染的影響

不同種的球蟲感染對血清中類胡蘿卜素含量變化的影響并不一致。堆型艾美爾球蟲感染后血清類胡蘿卜素變化的規(guī)律與Ruff等（1974）的報道一致。而柔嫩艾美爾球蟲降低血清中類胡蘿卜素含量出現(xiàn)在感染的7 d之后并影響到感染后的第14 d，這是以往研究中所未曾提及的。引起這一現(xiàn)象的原因尚不清楚，可能與本實(shí)驗(yàn)感染球蟲卵的數(shù)目較低有關(guān)。

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