楊家?guī)?湯江武 姚曉紅 孫 宏 葛向陽

新的研究結(jié)果表明，日糧中的蛋白質(zhì)經(jīng)消化道內(nèi)一系列酶的作用，最終是以游離氨基酸和小肽兩種形式同時被動物吸收利用，因此，蛋白質(zhì)的吸收利用并不只是簡單地遵循氨基酸平衡的“木桶”理論。蛋白質(zhì)被分解成小肽后，不僅能以完整形式被動物吸收利用，與游離氨基酸相比，小肽的吸收還具有速度快，耗能低，不易飽和，各種肽之間運轉(zhuǎn)無競爭性與抑制性等特性（胡佐忠，2007）。鑒于小肽具有的特殊的營養(yǎng)和生理作用，小肽的相關(guān)研究已成為蛋白質(zhì)營養(yǎng)領(lǐng)域的研究熱點。菜粕有較高的蛋白含量，其氨基酸組成也比較平衡，是一種潛在的、優(yōu)質(zhì)的小肽資源。我國有著較豐富的菜粕資源，因此如何使菜粕轉(zhuǎn)化成富含小肽、品質(zhì)更優(yōu)、利用率更高的飼用蛋白原料，將對緩解我國養(yǎng)殖業(yè)和飼料行業(yè)優(yōu)質(zhì)蛋白資源的缺乏提供一個新的途徑。

酶解法是一種常用的制備多肽、小肽的方法。目前，通過酶解法，利用植物源性蛋白質(zhì)制備小肽的研究，主要集中在以植物源蛋白的提取物為酶解底物的研究上，而以菜粕固體原料作為底物，直接進行酶解的研究鮮見報道。本研究通過在菜粕固體料中直接添加中性蛋白酶，對菜粕蛋白進行酶解，以期提高菜粕中小肽的含量并降低硫甙的含量，同時對影響酶解效果的因素和條件進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

菜粕：紹興中大生物科技有限公司提供，粗蛋白含量≥36%；中性蛋白酶：購自上海博蘊生物科技有限公司，Sigma公司生產(chǎn)，酶活≥10萬單位/g；其他常規(guī)試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 菜粕酶解方法

稱取適量菜粕，以一定料水比加入水和酶的混合液，混勻，裝入罐頭瓶中，用封口膜封口，放入設(shè)定溫度培養(yǎng)箱中酶解，在實驗選取的時間取出，50℃烘干，粉碎，過80目篩待測。

1.2.2 菜粕酶解條件研究

1.2.2.1 酶添加量對小肽含量的影響

稱取 50 g 菜粕，分別以 50、75、100、125、150 U/g的添加量，加入中性蛋白酶，料水比保持1：1.2，45℃下酶解24 h，測定小肽的含量。

1.2.2.2 酶解時間對小肽含量的影響

稱取50 g菜粕，在酶添加量為100 U/g，料水比為1： 1.2，45 ℃下酶解 12、24、36、48、60 h，測定小肽的含量。

1.2.2.3 料水比對小肽含量的影響

稱取 50 g 菜粕，分別以 1： 0.8、1： 1.0、1： 1.2、1： 1.4、1： 1.6的料水比，酶添加量為100 U/g，在45℃下酶解24 h，測定小肽的含量。

1.2.2.4 酶解溫度對小肽含量的影響

稱取50 g菜粕，在酶添加量為100 U/g，料水比為1： 1.4，分別在 35、40、45、50、55 ℃下酶解 24 h，測定小肽的含量。

1.2.3 酶解工藝優(yōu)化的正交試驗

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，菜粕酶解試驗的優(yōu)化采用酶添加量：100、125、150 U/g ；酶解時間：24、36、48 h ；料水比：1： 1.2、1： 1.4、1： 1.6；酶解溫度：45、50、55 ℃的4因素3水平正交試驗，共設(shè)9個處理，測定小肽含量，分析結(jié)果，得出最優(yōu)工藝條件。

1.2.4 酶活測定方法

參照浙江省地方標準DB33。

1.2.5 小肽含量測定方法

將待測樣品過80目篩，等體積加入10%三氯乙酸（TCA），在160 r/min搖床中30 min，而后4 000 r/min離心15 min，取上清液做適當稀釋后測定蛋白質(zhì)總量。

1.2.6 蛋白質(zhì)總量測定

采用凱氏定氮法，參照GB/T GB 6432——94。

1.2.7 硫甙含量測定方法

稱取樣品100 mg裝入10 ml試管中，在沸水浴中干熱10 min，加入約90℃熱蒸餾水8～10 ml，再置沸水浴中20min以上，冷卻后，蒸餾水稀釋，混勻，放置20min，用濾紙過濾或者4 000 r/min離心5 min。移取2 ml濾液于10 ml刻度試管中，加4 ml羧甲基纖維素鈉，再加入2 ml PbCl2，混勻，放置1 h。在540 nm下比色，以蒸餾水加羧甲基纖維素鈉做參比測定吸光度值E1。

再分別取濾液2 ml于另一帶塞的10 ml試管中，加入羧甲基纖維素鈉4 ml，0.03 mol/l HCl 2 ml，在室溫下放置2 h，以蒸餾水加羧甲基纖維素鈉做空白測定吸光度值E2。計算公式為E=E1-E2。最終的計算公式為：硫甙含量（μmol/g）=0.2+185.2E。

2 結(jié)果及分析

2.1 菜粕酶解條件的研究

2.1.1 酶添加量對酶解菜粕小肽含量的影響（見圖1）

利用中性蛋白酶酶解菜粕，可以提高菜粕中小肽的含量，而且隨著酶添加量的增加，菜粕中小肽含量也呈增加的趨勢。由圖1結(jié)果可見：當酶添加量為125 U/g時，酶解菜粕小肽的含量最高，為128.27 mg/g，比對照提高了282.44%。

2.1.2 酶解時間對酶解菜粕小肽含量的影響（見圖2）

以提取后的蛋白為底物的酶解，所需的時間都較短。但本試驗的工藝是直接以菜粕原料為底物，因此選取的酶解時間較長。由圖2結(jié)果可見：隨著酶解時間的延長，小肽的含量呈上升趨勢。酶解時間為48 h時，小肽的含量最高，為121.28 mg/g，比對照提高了261.60%。當酶解時間長于48 h，隨著酶解時間的延長，小肽被進一步酶解生成游離氨基酸，含量反而出現(xiàn)下降趨勢，因此酶解時間不宜過長，選擇48 h較為合適。

2.1.3 料水比對酶解菜粕小肽含量的影響（見圖3）

常規(guī)的酶解試驗，一般在料水比較小，即含水量較大的情況下進行。但含水率過高，會增加染雜菌的概率，同時增加后處理的難度和成本。本試驗選取的料水比較大，以增強工業(yè)生產(chǎn)可行性。由圖3結(jié)果可見，隨著原料含水率的增加，小肽的含量呈現(xiàn)增高的趨勢，當料水比為1：1.4時，小肽含量最高，為135.94mg/g，比對照提高了305.31%。物料含水率過大時，酶解菜粕中的小肽含量反而下降，這也與小肽被進一步降解成游離氨基酸有關(guān)，因此料水比選擇1：1.4較為合適。

2.1.4 酶解溫度對酶解菜粕小肽含量的影響

溫度是影響酶活性的一個重要因素，而酶活性的高低，直接影響酶解菜粕的小肽含量。由圖4結(jié)果可見，隨著酶解溫度的增高，酶的活性越來越高，小肽的含量也隨之升高，當酶解溫度為50℃時，達到最高，為125.57 mg/g，比對照提高了274.39%。酶解溫度高于50℃時，酶的活性下降，相應(yīng)的酶解菜粕中小肽的含量也明顯下降。因此，酶解溫度不宜高于50℃。

2.1.5 菜粕酶解工藝優(yōu)化的正交試驗

以單因素試驗為基礎(chǔ)，酶添加量、酶解時間、料水比、酶解溫度為因素，以小肽含量為指標設(shè)計4因素3水平正交試驗。試驗設(shè)計見表1，試驗結(jié)果見表2，試驗結(jié)果的正交分析見表3。

表1 正交試驗設(shè)計

表2 正交試驗設(shè)計和測定結(jié)果

由表2試驗結(jié)果可見，菜粕酶解的最佳條件為D1A2C1B3，即酶添加量為125 U/g，酶解時間為48 h，料水比為1：1.2，酶解溫度為45℃時，酶解菜粕中小肽含量有最大值。

表3中正交分析的結(jié)果表明，各因素對小肽含量影響的大小次序為D（酶解溫度）＞A（酶添加量）＞C（料水比）＞B（酶解時間）。其中，酶解溫度對小肽含量的影響最為顯著。

表3 正交試驗結(jié)果方差分析

2.1.6 酶解菜粕的工藝穩(wěn)定性

依照正交試驗得出的最優(yōu)工藝條件（酶添加量為125 U/g，料水比為 1：1.2，時間為48 h，酶解溫度為45℃），進行了5個批次的重復(fù)酶解處理試驗，檢測酶解菜粕工藝的穩(wěn)定性，結(jié)果見表4。

表4 酶解菜粕工藝穩(wěn)定性試驗結(jié)果

試驗結(jié)果表明：菜粕原料經(jīng)酶解后，小肽含量大幅提高，硫甙的含量也有相應(yīng)的降低，經(jīng)多批次重復(fù)試驗，小肽含量和硫甙含量指標均較穩(wěn)定。

3 結(jié)論

通過單因素和正交試驗，確定了中性蛋白酶酶解菜粕的最佳條件：酶添加量為125 U/g，酶解時間為48 h，料水比為1：1.2，酶解溫度為45℃，此時，小肽含量有最大值。依照正交試驗結(jié)果，對菜粕最佳酶解條件進行5次重復(fù)試驗驗證，酶解菜粕的小肽含量在135.10～139.60 mg/g之間，平均值為 137.26 mg/g，與正交試驗結(jié)果相符，說明酶解工藝是穩(wěn)定的。中性蛋白酶在提高菜粕中小肽含量的同時，對菜粕中的硫甙也有一定的去除效果，通過酶解，硫甙含量由原菜粕的50.94 μmol/g 降低到平均 26.31 μmol/g，降解率可達到48.34%。

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