角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)1C6細(xì)胞和4C18細(xì)胞的促增殖作用

張衛(wèi)星，劉彥隆，于洋，龔琦，李校堃，林紹強(qiáng)

角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子（keratinocyte growth factor，KGF）又稱成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 7，屬于成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族，是從人胚胎肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清中分離純化獲得的一種相對(duì)分子質(zhì)量為26 000～28 000 的單鏈多肽，這種細(xì)胞因子具有促進(jìn)小鼠角質(zhì)細(xì)胞有絲分裂的作用，因此被命名為角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子。隨后的一系列研究證明這種細(xì)胞因子的靶細(xì)胞為上皮細(xì)胞，分泌細(xì)胞為各種來(lái)源的間質(zhì)細(xì)胞，其作用是促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)。近年來(lái)的研究表明，KGF 具有廣泛的生物學(xué)活性，能促進(jìn)多種細(xì)胞中 DNA 的合成，與多種組織、器官的形成和發(fā)育有關(guān)，在胃腸[1]、口腔黏膜[2]、胸腺[3]、肺[4]等多種器官的損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。在胚胎胸腺器官培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，KGF 可誘導(dǎo)胸腺上皮祖細(xì)胞和成熟胸腺上皮細(xì)胞增殖[5]；胚胎期 KGF 受體缺失小鼠由于胸腺上皮細(xì)胞缺乏增殖和分化能力而表現(xiàn)出明顯的胸腺生成障礙[6]。最近有報(bào)道稱，KGF 可以明顯促進(jìn)老齡鼠萎縮胸腺的增生[7]，同時(shí)KGF 也可以促進(jìn)正常小鼠胸腺和接受骨髓移植后小鼠胸腺的增生[3]。研究表明 KGF 主要通過(guò)與胸腺上皮細(xì)胞表面的 KGF 受體結(jié)合而促進(jìn)胸腺上皮細(xì)胞增殖，最終導(dǎo)致胸腺增生。但由于胸腺上皮細(xì)胞較難分離及其在體外存活時(shí)間較短，因此KGF 促胸腺上皮細(xì)胞增殖的分子機(jī)制以及信號(hào)途徑尚不清楚。1C6 細(xì)胞和 4C18 細(xì)胞分別是鼠胸腺上皮髓質(zhì)和皮質(zhì)來(lái)源的細(xì)胞系，在此我們擬利用體外細(xì)胞培養(yǎng)方法觀察 KGF 對(duì) 1C6 細(xì)胞和 4C18細(xì)胞的促增殖作用，為探求 KGF 促胸腺增殖的分子機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 鼠胸腺上皮髓質(zhì)來(lái)源的 1C6 細(xì)胞、皮質(zhì)來(lái)源的 4C18 細(xì)胞和鼠腹腔巨噬細(xì)胞來(lái)源的 RAW 細(xì)胞均由中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所提供。

1.1.2 試劑 KGF 由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)提供；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司；噻唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自北京賽百盛生物工程公司；二甲基亞砜（DMSO）和牛血清白蛋白（BSA）購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；10%胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.2 方法

1.2.1 體外細(xì)胞培養(yǎng) 將 1C6 細(xì)胞、4C18 細(xì)胞和 RAW 細(xì)胞分別置于 DMEM 培養(yǎng)液（含 10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 U/ml 鏈霉素）中，在 37℃、5%CO2、飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，2～3 d 傳代 1 次。

1.2.2 細(xì)胞增殖活性測(cè)定 采用 MTT 法測(cè)定細(xì)胞增殖活性。實(shí)驗(yàn)分 KGF 處理組和對(duì)照組，每組各設(shè) 4 個(gè)復(fù)孔。分別將 1C6 細(xì)胞、4C18 細(xì)胞和RAW 細(xì)胞以 4×103/孔的密度接種于 96 孔板，待細(xì)胞貼壁后，KGF 處理組分別加入含 25、50、100、200、400、800 ng/ml KGF 的完全培養(yǎng)液 200 μl，對(duì)照組加入不含 KGF 的完全培養(yǎng)液 200 μl；同時(shí)以加入 200 μl 完全培養(yǎng)液作為空白孔。各組細(xì)胞經(jīng)不同處理后分別繼續(xù)培養(yǎng) 24、48 和 72 h，培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入 20 μl MTT（5 mg/ml）繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄培養(yǎng)上清液，每孔加入 200 μl DMSO，振蕩 10min，使藍(lán)紫色結(jié)晶充分溶解，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔波長(zhǎng) 492 nm處吸光度（A）值。按下列公式計(jì)算細(xì)胞增殖率：細(xì)胞增殖率（%）=（實(shí)驗(yàn)孔平均A值 － 對(duì)照孔平均A值）/對(duì)照孔平均A值×100%，并繪制細(xì)胞增殖率曲線。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組檢測(cè)結(jié)果的比較采用 Student’st檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KGF 對(duì) 1C6 細(xì)胞的促增殖作用

不同濃度（25、50、100、200、400、800 ng/ml）的 KGF 分別作用 1C6 細(xì)胞 24 h（圖1A）、48 h（圖1B）和 72 h（圖1C），MTT 法測(cè)定A492值并繪制細(xì)胞增殖率曲線，結(jié)果顯示在低濃度（＜200 ng/ml）時(shí)，細(xì)胞增殖率隨 KGF 濃度的增加不斷升高；當(dāng) KGF 濃度為200 ng/ml 時(shí)，細(xì)胞增殖率達(dá)到最高值；而在高濃度（＞ 200 ng/ml）時(shí)，細(xì)胞增殖率隨 KGF 濃度的增加又逐漸下降。

圖1 不同濃度（25、50、100、200、400、800 ng/ml）KGF 作用不同時(shí)間對(duì) 1C6 細(xì)胞的促增殖作用（A：不同濃度 KGF 作用 1C6細(xì)胞 24 h；B：不同濃度 KGF 作用 1C6 細(xì)胞 48 h；C：不同濃度KGF 作用 1C6 細(xì)胞 72 h）Figure 1 Proliferative effect on 1C6 cells affected by different concentrations of KGF (25, 50, 100,200, 400, 800 ng/ml) for different time.A: 1C6 cells were affected by different concentrations of KGF for 24 h; B: 1C6 cells were affected by different concentrations of KGF for 48 h; C: 1C6 cells were affected by different concentrations of KGF for 72 h.

與對(duì)照組比較，濃度為100、200、400 ng/ml 的KGF 分別作用 24、48 和 72 h 對(duì) 1C6 細(xì)胞均具有明顯的促增殖作用（均P＜0.05）。

2.2 KGF 對(duì) 4C18 細(xì)胞的促增殖作用

不同濃度（25、50、100、200、400、800 ng/ml）的 KGF 分別作用 4C18 細(xì)胞 24 h（圖2A）、48 h（圖2B）和 72 h（圖2C），MTT 法測(cè)定A492值并繪制細(xì)胞增殖率曲線，結(jié)果顯示在低濃度（＜100 ng/ml）時(shí)，細(xì)胞增殖率隨 KGF 濃度的增加不斷升高；當(dāng) KGF 濃度為100 ng/ml 時(shí)，細(xì)胞增殖率達(dá)到最高值；而在高濃度（＞ 100 ng/ml）時(shí)，細(xì)胞增殖率隨 KGF 濃度的增加又逐漸下降。

圖2 不同濃度（25、50、100、200、400、800 ng/ml）KGF 作用不同時(shí)間對(duì) 4C18 細(xì)胞的促增殖作用（A：不同濃度 KGF 作用 4C18 細(xì)胞 24 h；B：不同濃度 KGF 作用 4C18 細(xì)胞 48 h；C：不同濃度 KGF 作用 4C18 細(xì)胞72 h）Figure 2 Proliferative effect on 4C18 cells affected by different concentrations of KGF (25, 50, 100, 200, 400, 800 ng/ml)for different time.A: 4C18 cells were affected by different concentrations of KGF for 24 h; B: 4C18 cells were affected by different concentrations of KGF for 48 h; C: 4C18 cells were affected by different concentrations of KGF for 72 h.

與對(duì)照組比較，濃度為50、100、200、400 ng/ml的 KGF 分別作用 24、48 和 72 h 對(duì) 4C18 細(xì)胞均具有明顯的促增殖作用（均P＜0.05）。

2.3 KGF 對(duì) RAW 細(xì)胞的促增殖作用

不同濃度（25、50、100、200、400、800 ng/ml）的 KGF 分別作用 RAW 細(xì)胞 24、48 和 72 h，MTT 法測(cè)定A492值并繪制細(xì)胞增殖率曲線，結(jié)果顯示 KGF 對(duì) RAW 細(xì)胞均無(wú)明顯促增殖作用。

3 討論

KGF 作為一種有絲分裂原能特異性地促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖和分化[8]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明 KGF 對(duì)胸腺上皮髓質(zhì)和皮質(zhì)來(lái)源的 1C6 細(xì)胞和 4C18 細(xì)胞均具有明顯的促增殖作用。有研究報(bào)道，KGF 主要通過(guò)與胸腺上皮細(xì)胞表面 KGF 受體的結(jié)合而促進(jìn)老齡鼠萎縮胸腺以及理化因素所致小鼠萎縮胸腺的增生[7,9]。胸腺上皮構(gòu)成了胸腺細(xì)胞賴以生存的微環(huán)境，是 T 細(xì)胞發(fā)育和成熟的主要場(chǎng)所，為骨髓來(lái)源的胸腺前體細(xì)胞提供了足夠的生存空間，因此胸腺上皮細(xì)胞的增生，擴(kuò)大了 T 細(xì)胞的生存環(huán)境，促進(jìn)胸腺細(xì)胞生成增加，導(dǎo)致胸腺的增生[10]。但是由于胸腺上皮細(xì)胞分離技術(shù)尚未成熟及其體外生存時(shí)間很短，所以至今為止 KGF 與KGF 受體信號(hào)途徑對(duì)胸腺促增殖作用的具體機(jī)制，以及該途徑中上游或下游的作用因子尚未闡明。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 KGF 對(duì)胸腺上皮髓質(zhì)和皮質(zhì)來(lái)源的 1C6 細(xì)胞和 4C18 細(xì)胞均具有明顯的促增殖作用，但是對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞來(lái)源的 RAW 細(xì)胞無(wú)促增殖作用，表明 KGF 可特異性對(duì) 1C6 和 4C18細(xì)胞發(fā)揮促增殖作用。這將為下一步探討 KGF 促進(jìn)胸腺增生的分子機(jī)制和信號(hào)途徑提供可能性。

[1]Johansson JE, Hasséus B, Johansson P, et al.Gut protection by palifermin during autologous haematopoietic SCT.Bone Marrow Transplant, 2009, 43(10):807-811.

[2]Beaven AW, Shea TC.Recombinant human keratinocyte growth factor palifermin reduces oral mucositis and improves patient outcomes after stem cell transplant.Drugs Today (Barc), 2007, 43(7):461-473.

[3]Rossi SW, Jeker LT, Ueno T, et al.Keratinocyte growth factor (KGF)enhances postnatal T-cell development via enhancements in proliferation and function of thymic epithelial cells.Blood, 2007,109(9):3803-3811.

[4]Sadovski J, Kuchenbuch T, Ruppert C, et al.Keratinocyte growth factor prevents intra-alveolar oedema in experimental lung isografts.Eur Respir J, 2008, 31(1):21-28.

[5]Berzins SP, Uldrich AP, Sutherland JS, et al.Thymic regeneration:teaching an old immune system new tricks.Trends Mol Med, 2002,8(10):469-476.

[6]Revest JM, Suniara RK, Kerr K, et al.Development of the thymus requires signaling through the fibroblast growth factor receptor R2-IIIb.J Immunol, 2001, 167(4):1954-1961.

[7]Min D, Panoskaltsis-Mortari A, Kuro-O M, et al.Sustained thymopoiesis and improvement in functional immunity induced by exogenous KGF administration in murine models of aging.Blood,2007, 109(6):2529-2537.

[8]Loprinzi CL, Martenson JA.Martenson, Keratinocyte growth factor:not yet ready for prime time.J Clin Oncol, 2003, 21(8):1429-1430.

[9]Alpdogan O, Hubbard VM, Smith OM, et al.Keratinocyte growth factor (KGF) is required for postnatal thymic regeneration.Blood,2006, 107(6):2453-2460.

[10]Zhang L, Sun L, Zhao Y.Thymic epithelial progenitor cells and thymus regeneration: an update.Cell Res, 2007, 17(1):50-55.