不同產(chǎn)地白三葉種質(zhì)遺傳多樣性的SRAP分析

張婧源，彭燕，羅燕，馬嘯

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系，四川 雅安625014）

相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence－related amplified polymorphism，SRAP）是一種新型的基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的標(biāo)記系統(tǒng)，也稱基于序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence－based amplified polymorphism，SBAP）。是利用獨(dú)特的引物設(shè)計(jì)對(duì)ORFs（open reading frames，開放閱讀框架）進(jìn)行擴(kuò)增。由于SRAP技術(shù)簡便、快速，不需預(yù)知物種的序列信息，故而近年來在植物遺傳多樣性分析［1］、種質(zhì)鑒定［2］、遺傳連鎖圖的構(gòu)建［3］、基因連鎖標(biāo)記的尋找與基因定位［4］和比較基因組學(xué)研究［5］等方面得到廣泛應(yīng)用。目前在蕓苔屬（Brassica）［4］、南瓜屬（Cucurbita）［6］、芍藥屬（Paeonia）［7］以及柿子（Diospyroskaki）等植物［8］已經(jīng)展開SRAP標(biāo)記的研究工作，并已取得了一定的成果。在草業(yè)上SRAP也已有了較多的應(yīng)用，如野牛草（Buchlo?dactyloides）［9］、垂穗披堿草（Elymusnutans）［10］和結(jié)縷草（Zoysiajaponica）［11，12］等草種，但就豆科（Leguminosae）植物而言，僅見于紫花苜蓿（Medicagosativa）［13］、花生（Arachishypogaea）［14］等少數(shù)植物。

白三葉（Trifoliumrepens）別名白車軸草、荷蘭翹搖，為豆科（Leguminosae），三葉草屬（Trifolium），全屬在世界約有250余種，原產(chǎn)于歐洲、北非和亞洲西部，在溫帶及亞熱帶地區(qū)均有分布。為世界上分布最廣的豆科牧草之一［15］。由于白三葉莖葉細(xì)軟，葉量多，營養(yǎng)豐富，尤富含蛋白質(zhì)，適口性好，刈牧兼用，耐踐踏，再生性好等特點(diǎn)使其種植已遍布我國各地，尤其在長江以南地區(qū)大面積栽培，在長江中下游平原的鄂、湘、江、浙、皖等省，以及低山丘陵區(qū)的云、貴、川、廣等省均有種植，是我國南方的當(dāng)家豆科牧草［16］。國內(nèi)外學(xué)者已通過形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記和同工酶生化標(biāo)記等，對(duì)白三葉種質(zhì)的遺傳結(jié)構(gòu)與生態(tài)型遺傳分化及種質(zhì)間遺傳多樣性進(jìn)行研究［17－19］。由于分子標(biāo)記技術(shù)簡單、快捷、受環(huán)境影響小和可重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，目前已被廣泛應(yīng)用在牧草遺傳研究中，因此對(duì)白三葉種質(zhì)資源的遺傳多樣性方面的研究也逐步深入到了分子水平。在國外，對(duì)白三葉的分子水平上的研究相對(duì)更多，Sharmas等［20］利用形態(tài)學(xué)和RAPD分子標(biāo)記（隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記）對(duì)外來引進(jìn)白三葉品種遺傳多樣性進(jìn)行了分析，Gustine和Huff［21］利用RAPD標(biāo)記分析了美國東北部3個(gè)州人工管理的多年生牧場中白三葉種群內(nèi)和種群間的遺傳變異，Joyce等［22］利用RAPD－PCR分子標(biāo)記（基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記）對(duì)近緣雜交的白三葉的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，George等［23］利用SSR標(biāo)記（串聯(lián)重復(fù)序列DNA標(biāo)記）檢測(cè)了不同產(chǎn)地白三葉品種的遺傳多樣性，K?lliker等［24］對(duì)白三葉進(jìn)行了AFLP分子標(biāo)記（擴(kuò)增片段長度多態(tài)性DNA標(biāo)記），Barrett等［5］更首次利用EST－SSRs（基于表達(dá)序列標(biāo)簽的串聯(lián)重復(fù)序列DNA標(biāo)記）制作了白三葉的完整基因連鎖圖；而國內(nèi)對(duì)于白三葉在DNA分子遺傳多樣性方面的研究報(bào)告相對(duì)較少，隨著白三葉在我國草地畜牧業(yè)、農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)結(jié)構(gòu)調(diào)整和生態(tài)環(huán)境建設(shè)等方面占有越來越重要的地位和作用，急切的需要開展更進(jìn)一步的分子水平的白三葉種質(zhì)資源遺傳特性的基礎(chǔ)研究。

本試驗(yàn)利用SRAP標(biāo)記技術(shù)對(duì)來自5大洲的41份白三葉種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性研究，目的在于：1）檢測(cè)白三葉種質(zhì)資源遺傳多樣性水平與地理來源的關(guān)系；2）分析白三葉種質(zhì)資源的遺傳多樣性，為優(yōu)良白三葉種質(zhì)資源篩選提供依據(jù)；3）揭示白三葉種質(zhì)資源的遺傳結(jié)構(gòu)及親緣關(guān)系，為白三葉種質(zhì)資源的保護(hù)、栽培利用以及核心種質(zhì)的構(gòu)建提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的41份白三葉種質(zhì)材料均來源于美國國家遺傳資源庫（United States Department of Agriculture），其中源自非洲的材料有8份、亞洲7份、大洋洲5份、歐洲13份、美洲6份、亞歐交界2份（表1）。每份材料取50粒種子，置于有蓋培養(yǎng)皿內(nèi)的吸水濾紙上萌發(fā)。萌發(fā)后的種子移栽至四川省眉山市洪雅縣國家種質(zhì)資源圃（東經(jīng)102°49′～103°32′，北緯29°24′～30°00′，海拔2 800 m）種植。

1.2 白三葉基因組DNA提取

本試驗(yàn)于2009年7月進(jìn)行。每份材料采用Saghai－Maroof等［25］的CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）方法隨機(jī)選取10～15個(gè)生長良好的單株的幼嫩葉片等量混合提取DNA。對(duì)比已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)λDNA與樣本DNA在0.8%（w／v）瓊脂糖凝膠上的電泳圖譜，計(jì)算出白三葉各種質(zhì)材料的DNA濃度。將所有樣本的基因組DNA用0.1×TE緩沖液［1 mmol／L Tris－HCl，0.1 mmol／L EDTA（乙二胺四乙酸），p H 8.0］稀釋至10 ng／μL，儲(chǔ)存于－80℃冰箱內(nèi)，供SRAP擴(kuò)增使用。

1.3 SRAP反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化

參照前人發(fā)表的SRAP反應(yīng)體系［26－28］，利用單因素梯度組合試驗(yàn)的方法，得到優(yōu)化后20μL SRAP反應(yīng)體系：模板DNA 2μL（10 ng／μL），10×PCR Bufer 2μL，Mg2＋2μL（25 mmol／L），d NTP 1.4μL（2.5 mmol／L），Taq DNA聚合酶0.4μL（2.5 U／μL），上、下游引物均為1μL（10μmol／μL），滅菌水補(bǔ)足20μL。

1.4 引物篩選和PCR反應(yīng)

參照前人發(fā)表的引物［29－33］，由9個(gè)上游引物和12個(gè)下游引物組合成108對(duì)SRAP引物序列，交由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，選取4個(gè)DNA質(zhì)量較高且田間試驗(yàn)性狀差異較大的材料PI282379，PI404930，PI291841，PI440745對(duì)108對(duì)引物進(jìn)行篩選，最終選出20對(duì)條帶清晰、穩(wěn)定性高、多態(tài)性好的引物用于全部材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見表2。

PCR擴(kuò)增程序參見Li和Quiros［4］的方法，采用以下程序：循環(huán)包括94℃變性5 min；94℃變性1 min，35℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，共5個(gè)循環(huán)；之后35個(gè)循環(huán)：94℃變性1 min，50℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，最后72℃延伸10 min；4℃保存。

1.5 電泳檢測(cè)

擴(kuò)增產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺凝膠上（丙烯酰胺∶甲叉＝19∶1，7 mol／L尿素，1×TBE緩沖液）進(jìn)行電泳檢測(cè)。樣孔中每樣品點(diǎn)樣10μL，以博瑞克公司的D2000 DNA梯度Marker為對(duì)照，先在北京六一電泳儀廠的DYY－6C電泳儀上進(jìn)行200 V恒定電壓下30 min的預(yù)電泳，然后在400 V恒定電壓下電泳90～100 min，停止電泳后再用0.1%的Ag NO3進(jìn)行銀染色并在NaOH液中顯色［29］，凝膠在燈光下用高分辨率數(shù)碼相機(jī)照相保存以供分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理

對(duì)獲得的清晰可重復(fù)的DNA條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，在相同遷移位置上，將穩(wěn)定出現(xiàn)的有條帶的記為1，無帶的記為0，依次構(gòu)成遺傳相似矩陣。

據(jù)表征矩陣，統(tǒng)計(jì)SRAP擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶總數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)量，計(jì)算多態(tài)性位點(diǎn)百分率（PPB，percentage of polymorphic bands）、引物多態(tài)性信息含量（PIC，polymorphism information content）和Dice遺傳相似系數(shù)（GS）

來估計(jì)各種質(zhì)間的遺傳多樣性［30，34，35］。各遺傳參數(shù)按以下公式計(jì)算：PPB＝NPB／TNB，式中，TNB指總擴(kuò)增的SRAP條帶數(shù)（total number of bands），NPB指多態(tài)性條帶數(shù)（number of polymorphic bands）；PICi＝2fi（1－fi），式中，PICi表示引物“i”的多態(tài)性信息含量，“fi”表示有帶所占的頻率，“1－fi”表示無帶所占的頻率，對(duì)每個(gè)引物組合而言，計(jì)算PIC應(yīng)該求平均值，即PICav＝∑PICi／N，這里N是各引物組合的多態(tài)性帶數(shù)（NPB）［31］；標(biāo)記指數(shù)（MI，marker index）MI＝NPB×PIC［23］。在 Hardy－Weinberg平衡的基礎(chǔ)上，計(jì)算各種質(zhì)材料 Nei基因多樣性指數(shù)［33］，利用 NTSYS－PC 2.10軟件計(jì)算 Dice遺傳相似性系數(shù)（GS），根據(jù) UPGMA 法［36］進(jìn)行聚類分系和主成分分析（PCo A）。

表1 供試材料及來源Table 1 The test materials and sources of T.repens

表2 用于白三葉SRAP分析的引物序列Table 2 Primer and sequences used in SRAP analyses of T.repens

以上參數(shù)計(jì)算分別在POPGENE 1.31、DCFA 1.1中進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試白三葉SRAP擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性分析

從108對(duì)引物組合中篩選出20對(duì)條帶清晰、多態(tài)性好的引物組合（表3）對(duì)41份白三葉基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共得到479條清晰可辨的條帶，平均每對(duì)引物組合擴(kuò)增出23.95條帶，me5＋em9引物組合擴(kuò)增出最多的44條帶，而me4＋em6組合擴(kuò)增出的條帶最少，僅有13條；多態(tài)性條帶總數(shù)411條，平均每對(duì)引物擴(kuò)增20.55條，引物的平均多態(tài)性位點(diǎn)百分率（PPB）為85.16%，不同的SRAP引物組合所揭示的參試材料的多態(tài)性信息含量（PIC）范圍為0.182～0.334，平均為0.268；不同的SRAP引物組合的標(biāo)記指數(shù)（MI）為2.185～11.068，平均為5.697。結(jié)果表明SRAP分子標(biāo)記能檢測(cè)出較多的白三葉遺傳位點(diǎn)，獲得多態(tài)性相對(duì)較好的PCR結(jié)果。

表3 白三葉SRAP分析的引物組合以及其序列擴(kuò)增結(jié)果Table 3 Primer combinations and sequences used in SRAP analyses of T.repens

2.2 不同產(chǎn)地白三葉種質(zhì)親緣關(guān)系分析

對(duì)擴(kuò)增結(jié)果用Nei－Li相似系數(shù)（GS）和遺傳距離（GD）的計(jì)算方法，得到供試材料相似性矩陣。41份白三葉材料的 GS值為0.586 6～0.989 6，GS平均值為0.730 7，變幅為0.403，其遺傳距離GD（1－GS）為0.010 40～0.413 40，平均為0.269 4。其中，來自非洲肯尼亞的PI516408與來自歐洲法國的PI294544之間的遺傳距離最大，為0.413 4，表明它們之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。而來自非洲南部的2份種質(zhì)PI300155和PI300156之間的遺傳距離最小，僅為0.010 4，表明這2份材料之間具有很近的親緣關(guān)系。分析結(jié)果表明，供試材料之間差異明顯，具有相對(duì)較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。

2.3 不同產(chǎn)地白三葉種質(zhì)的聚類分析

基于（Nei－Li）遺傳相似系數(shù)，利用UPGMA法（非加權(quán)組平均法）構(gòu)建了41份白三葉材料間的遺傳關(guān)系聚類圖（圖1）。在遺傳相似系數(shù)為0.71的水平上，可將供試白三葉種質(zhì)分為3大類。其中，非洲、亞洲和大洋洲的20份材料聚為第Ⅰ類，該類大部分種質(zhì)的形態(tài)及農(nóng)藝性狀表現(xiàn)為前期生長速度快、分蘗能力強(qiáng)、花期遲、完成生育期所需時(shí)間較短，植株相對(duì)高大，生態(tài)適應(yīng)能力較強(qiáng)。該大類中源于非洲的8份材料，PI282379、PI300155、PI300156、PI226102、PI516408、PI278171、PI517515、PI322699優(yōu)先聚為A亞類，然后源于大洋洲的5份材料，PI517508、PI190125、PI291844、PI291841、PI291849聚為B亞類，源于亞洲的7份材料，PI420014和PI420010，PI227874和PI239983以及PI221962、PI223297和PI269981分屬于C、D、E亞類。來自歐洲和美洲的19份材料，PI237734、PI232112、PI294544、PI288084、PI288085、PI249873、PI221524、PI234489、PI516410、PI237292、PI315543、PI208567、PI282377、PI404930、NSL5459、G15242、PI306286、PI291826和PI308549聚為第Ⅱ類，該類主要特征表現(xiàn)為花期較早，植株低矮，葉片極小。而來自亞歐交界處的2份材料，PI209986和PI440745單獨(dú)成為第Ⅲ類。這樣的聚類結(jié)果揭示了供試材料的聚類與其形態(tài)特征、最初的地理來源以及地理分布存在一定相關(guān)性。

圖1 41份白三葉種質(zhì)基于Nei－Li相似系數(shù)的UPGMA聚類圖Fig.1 UPGMA dendrogram for T.repens based on Nei－Li’s genetic similarity coefficients

2.4 供試材料的主成分分析

對(duì)41份白三葉材料的SRAP標(biāo)記的原始矩陣進(jìn)行主成分分析，前2個(gè)主成分所能解釋的遺傳變異分別為15.83%和8.16%，對(duì)41份種質(zhì)做前2個(gè)主成分的三維排序圖，位置靠近者表示關(guān)系密切，遠(yuǎn)離者表示關(guān)系疏遠(yuǎn)，將位置靠近的白三葉材料歸為一類，可將供試材料分成3類，所形成的白三葉材料的位置分布圖（圖2）所示，主成分分析結(jié)果與聚類結(jié)果基本一致，同一地區(qū)的大部分白三葉材料基本能聚在一起，主成分分析的結(jié)果更直觀地表明了不同白三葉材料之間的親緣關(guān)系，是對(duì)聚類分析結(jié)果的直觀解釋和佐證。

3 討論

3.1 SRAP分子標(biāo)記對(duì)白三葉遺傳多樣性研究的有效性

本研究利用SRAP標(biāo)記對(duì)41份白三葉種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性的分析，結(jié)果表明，白三葉SRAP標(biāo)記表現(xiàn)出較高的多態(tài)性，高于RAPD分子標(biāo)記對(duì)三葉草屬其他物種的研究，例如Kongkiatngam等［37］對(duì)不同地區(qū)紅三葉栽培品種的RAPD分析研究中所選樣本的PPB為69.6%，Ulloa等［38］對(duì)紅三葉（Trifoliumpratense）的RAPD研究所得的PPB為74.2%，同時(shí)也高于同科植物紫花苜蓿的SRAP分析結(jié)果（PPB為83.88%）［39］，這些差異可能是由于材料和研究方法的不同造成的。由此說明SRAP技術(shù)對(duì)白三葉的擴(kuò)增具有較高的效率，適合對(duì)大規(guī)模白三葉種質(zhì)的遺傳變異檢測(cè)，可作為白三葉新品種選育的早期選擇及分子標(biāo)記輔助育種的有力工具。

圖2 41份白三葉種質(zhì)基于Nei－Li相似系數(shù)的主成分分析Fig.2 The principal coordinate analysis（PcoA）of 41 T.repens based on Nei－Li’s genetic similarity coefficients

3.2 白三葉種質(zhì)遺傳變異與地理來源的相關(guān)性分析

遺傳變異和地理環(huán)境之間的關(guān)系一直是植物遺傳學(xué)研究中普遍關(guān)注的問題。本試驗(yàn)通過對(duì)41份來自世界各地不同大洲的白三葉材料的SRAP統(tǒng)計(jì)分析和聚類分析，證明供試白三葉種質(zhì)呈現(xiàn)出一定地理來源分布規(guī)律和地域分布性規(guī)律，這也與Wilson等［40］的研究所得，種質(zhì)的地理分布與分子標(biāo)記間存在相關(guān)性的結(jié)論相符合。通過研究發(fā)現(xiàn)白三葉材料間存在著較高的遺傳分化，而聚類分析把41份材料分為3大類，也揭示了3個(gè)與地理起源密切相關(guān)的遺傳多樣性資源群。從供試材料的聚類圖可以看出，相似的生態(tài)環(huán)境或地理來源的白三葉種質(zhì)能聚為一類，主要表現(xiàn)在來自美洲和歐洲的全部材料聚為第II類，這種聚類分析的結(jié)果可能與白三葉起源于歐洲，并由歐洲傳入美洲有關(guān)，由于大陸間地形的相互阻隔造成了基因漂移的阻隔，加上相同起源地白三葉材料原有基因突變?cè)谖锓N進(jìn)化過程中適應(yīng)了各地域間海拔高度、土壤類型、氣候特征和降水等方面存在的差異，從而使其固有的個(gè)別變異基因得以保存并延續(xù)下來，最終使不同來源地的白三葉材料間呈現(xiàn)出按起源地分布的規(guī)律，這一研究結(jié)果與謝國祿［41］的研究相一致。

與此同時(shí)第I類在GS為0.75時(shí)，來自非洲的全部材料和來自大洋洲的全部材料又分別聚為A、B 2個(gè)亞類，這說明白三葉種質(zhì)資源呈現(xiàn)一定的地域分布規(guī)律，而造成這一結(jié)果可能是在白三葉材料的長期進(jìn)化過程中由于所處生長環(huán)境的不同，地理類型、土壤酸堿度、年積溫和年降水量、日照時(shí)數(shù)等生態(tài)環(huán)境因子的明顯差異對(duì)白三葉生長期的自然選擇造成一定影響，加上自然突變、人為選擇等其他因素，使各方面都存在了一定的變異度，使得個(gè)體中發(fā)生的不定向變異導(dǎo)致群體遺傳結(jié)果的定向變異，最終使同一地區(qū)材料的基因型趨近于相似。

另外部分聚類也非完全符合地理起源和地域性的分布規(guī)律，如來自亞洲的所有材料在GS為0.75時(shí)就分別聚成了C、D、E 3個(gè)亞類，造成這種聚類劃分的現(xiàn)象可能有以下方面的原因：1）白三葉是異花授粉植物，花粉間的竄粉可能導(dǎo)致天然雜交現(xiàn)象的出現(xiàn)；2）本研究的材料來源于生境差別較大，其光照、降水、年均溫等氣候條件以及土壤、海拔、經(jīng)緯度、洋流等生境條件存在差異，因此可能阻礙種質(zhì)間的基因漂移，從而造成了較明顯的遺傳差異，這也符合聚類結(jié)果與生境表現(xiàn)出一定的相關(guān)性［42］的研究結(jié)論；3）由于自然選擇所造成的選擇壓力也可能導(dǎo)致生境相距存在差異的種質(zhì)產(chǎn)生遺傳變異，加上人類活動(dòng)以及利用方式的不同都可能導(dǎo)致其個(gè)別基因發(fā)生變異［43］，從而形成遺傳的多樣性，這也符合聚類的結(jié)果反映出自然和人工選擇的深刻影響［14］的研究結(jié)論。

這一研究結(jié)果為今后制定世界范圍內(nèi)白三葉資源遺傳多樣性原位保護(hù)措施、保護(hù)范圍以及白三葉品種改良中親本選擇、發(fā)掘新的抗逆基因提供了重要參考。針對(duì)白三葉所潛藏的巨大的可選擇利用的優(yōu)異性狀，應(yīng)充分發(fā)掘其原生種質(zhì)的遺傳潛力，培育出更多適應(yīng)性更強(qiáng)，農(nóng)藝性狀更優(yōu)良的品種。

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