李杰勤，王麗華，詹秋文，范軍成

（安徽科技學(xué)院植物科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽233100）

高粱（Sorghumbicolor）是禾本科一年生草本植物，因其具有抗旱、耐澇、耐鹽堿和適應(yīng)性強等特性，是世界第五大糧食作物，同時又是一種優(yōu)質(zhì)飼料作物［1－3］。棕色中脈（Brown midrib，bmr）是指葉脈和莖稈木質(zhì)部呈棕灰或紅棕色的自然或化學(xué)突變體。研究發(fā)現(xiàn)［4］，葉片中脈顏色與木質(zhì)素含量和組成有著密切關(guān)系。一般認(rèn)為總木質(zhì)素含量和木質(zhì)素單體的組成比例對細(xì)胞壁的可消化性影響較大［5］。在飼用高粱及高粱－蘇丹草（Sorghum sudanense）雜交種中，棕色中脈與傳統(tǒng)的白色中脈品種相比，其葉和秸稈中家畜可消化的纖維素和半纖維素含量增加，而難以消化的木質(zhì)素含量降低40%～60%，極大地提高了葉和秸稈的適口性，各種放牧家畜特別喜食，同樣的飼喂量可獲得更高的效益。因此利用棕色中脈突變體來改善飼用高粱及高粱－蘇丹草雜交種品質(zhì)引起了各國研究者的廣泛關(guān)注。

1924年，棕色中脈突變體首先在玉米（Zeamays）中被發(fā)現(xiàn)，接著在高粱、珍珠粟（Pennisetumamericarum）等作物中陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)［6，7］。高粱中的棕色中脈類型較多，目前已經(jīng)報道的類型有19種，其中既有自然突變體也有化學(xué)突變體［8］。在這些類型中，最重要的主要有bmr－6、bmr－12和bmr－18三種類型［9，10］。因為這3種類型的可消化率遠(yuǎn)高于其他類型，因此應(yīng)該是與木質(zhì)素合成有關(guān)的基因發(fā)生突變的結(jié)果。等位分析證明bmr－12和bmr－18是等位基因，bmr－6和bmr－12位于不同的染色體上［11］。日前，bmr－12和bmr－18基因已經(jīng)克隆，但 bmr－6基因定位還未見相關(guān)報道。

本研究利用從美國引進(jìn)的高粱棕色中脈材料（bmr－6類型）與白色中脈材料的雜交F2分離群體，分析了高粱棕色中脈基因bmr－6的遺傳特點，并利用分子標(biāo)記對bmr－6進(jìn)行了基因定位，為進(jìn)一步對bmr－6基因的克隆和利用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

棕色中脈材料N592是由美國Nebraska－Lincoln大學(xué)提供。N592是由N121（bmr－6）與Rox Orange進(jìn)行多代回交選育而成。

1.2 定位群體的構(gòu)建

將高粱棕色中脈材料N592分別和白色中脈材料Sa和S722分別進(jìn)行雜交，獲得F1代。將F1植株單穗進(jìn)行套袋自交，獲得F2代分離群體。2008年將該群體種植在安徽科技學(xué)院農(nóng)場中，種植密度為行距50 cm，株距30 cm，常規(guī)肥水管理。

1.3 定位親本葉中脈組織切片

在能辨別棕色中脈和白色中脈性狀的6葉期，取N592和Sa的葉中脈，徒手切片，切片置于載玻片上，加入1滴間苯三酚／鹽酸試劑（2 mol／L鹽酸，1% 間苯三酚，溶于95%乙醇），室溫放置1 min后，觀察拍照。

1.4 χ2測驗

1.5 DNA提取

在6葉期對F2單株的棕色中脈單株進(jìn)行統(tǒng)計，并取幼嫩葉片。同時取N592和Sa雙親的幼嫩葉片，并做好編號標(biāo)記。

DNA的提取方法，參照Brown等［12］的方法，取嫩葉片0.5 g，加液氮研磨成粉末，加500 m L提取液（65℃）搖勻，65℃溫浴30 min；加20μL KAC（預(yù)冷），冰浴20 min，禁止搖動；加400μL氯仿／異戊醇（24∶1）搖勻，10 000 r／min離心10 min；取上清液于離心管中，加入預(yù)冷的無水乙醇；吸出位于液面上白色絮狀物DNA，之后用70%的乙醇沖洗2次，加無水乙醇脫水1次，保存。

1.6 SSR反應(yīng)體系

采用25μL體系：10×Buffer（無 Mg2＋）2.0μL，MgCl22.0μL（25 mmol／L），引物：前引物1.0μL（10 μmol／L），后引物1.0μL（10μmol／L），d NTP 2.0μL（25 mmol／L），模板DNA 2.0μL（50 ng／μL），雙蒸水14.8 μL。

1.7 SSR標(biāo)記分析

選取均勻分布在高粱10個連鎖群上的171對SSR引物進(jìn)行PCR擴增。SSR引物為txp系列，具體名稱和分布見表1，引物序列參考網(wǎng)站www.gramene.org。SSR引物全部由biosino公司合成。

表1 高粱SSR引物名稱及分布Table 1 The SSR markers name and distribution on S.bicolor linkage group

1.8 PCR擴增

PCR反應(yīng)按如下程序進(jìn)行：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min循環(huán)36次，72℃延伸7 min，4℃保存。反應(yīng)完成后，加入2.0μL的溴酚藍(lán)，3%的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶（EB）染色，凝膠成像系統(tǒng)（PCR）拍照。

1.9 遺傳作圖

將在親本間有差異的SSR引物對隱性群體進(jìn)行PCR擴增，將與母本條帶一致的個體賦值為0，與父本一致的為1，雙帶為2。將群體基因型數(shù)據(jù)歸類，用Exp 3.0b作圖軟件進(jìn)行連鎖分析［13］，采用Kosambi函數(shù)將重組值轉(zhuǎn)換為遺傳圖距。

2 結(jié)果與分析

2.1 N592和Sa的葉中脈表型及其組織切片

普通高粱葉中脈有4種顏色，即白色、綠色、黃色和淺灰色。N592為淺棕色，Sa為白色。兩者在顏色上差別較大，但衰老葉片的葉色中脈都為白色。因此，在收獲棕色中脈的飼用高粱要早于普通飼用高粱，以便于減少營養(yǎng)損失。

間苯三酚是一種用來檢測植物組織中木質(zhì)素的常用試劑。木質(zhì)素能和間苯三酚／鹽酸試劑產(chǎn)生紅色的化合物。因此，如果組織中紅色越深則說明木質(zhì)素含量越高，纖維素和半纖維素含量則相應(yīng)降低。N592的紅色比Sa要淺得多（圖1），而且N592被染紅的主要分布在韌皮部，而Sa則在髓部、韌皮部、木質(zhì)部及表皮都被染成了紅色。這也說明Sa的木質(zhì)素含量要遠(yuǎn)高于N592。

2.2 高粱棕色中脈基因的遺傳行為分析

以N592分別與Sa和S722進(jìn)行雜交，獲得的F1代，葉脈表現(xiàn)全為白色中脈，這表明棕色中脈基因為隱性遺傳。將F1代進(jìn)行套袋自交，獲得的F2代分離群體。F2分離群體中，白色中脈和棕色中脈分離符合1對等位基因的分離規(guī)律（表2）。通過χ2測驗，說明棕色中脈bmr－6受1對隱性等位基因控制。

2.3 N592和Sa引物篩選

由于N592和Sa雜交F2群體在數(shù)量上和χ2測驗的結(jié)果都優(yōu)于N592和S722，因此選擇了N592和Sa雜交F2群體為定位群體。選擇了171對SSR標(biāo)記對定位群體親本進(jìn)行了PCR擴增，N592和Sa兩個親本間的SSR標(biāo)記進(jìn)行了多態(tài)性篩選。在擴增的171對引物中，24對能夠揭示親本間的多態(tài)性（圖2），多態(tài)性頻率為14.1%。

圖1 N592和Sa葉中脈組織切片F(xiàn)ig.1 The midrib histological section

表2 高粱棕色中脈基因的χ2測驗Table 2 Theχ2 test of sorghum brown midrib gene

圖2 定位親本間多態(tài)性引物篩選Fig.2 Screening of SSR markers in parents

圖3 SSR標(biāo)記txp295在F2隱性群體中的部分?jǐn)U增結(jié)果Fig.3 Amplification of txp295 in F2 recessive population

2.4 共分離標(biāo)記的篩選

應(yīng)用在雙親間表現(xiàn)多態(tài)性的24對差異標(biāo)記，對122個F2棕色中脈單株進(jìn)行PCR擴增（圖3）。對標(biāo)記和基因進(jìn)行了連鎖性分析，發(fā)現(xiàn)位于第1連鎖群的SSR標(biāo)記txp295與目的基因連鎖。經(jīng)Mapmaker分析，用Kosambi函數(shù)將重組值轉(zhuǎn)換為遺傳圖距，連鎖距離為4.2c M。因txp295位于第7連鎖群（表1），初步將該基因定位于第7連鎖群上（圖4）。

圖4 棕色中脈基因在高粱第7號連鎖群上的遺傳圖Fig.4 The genetic map of bmr－6 gene on S.bicolor linkage group 7

本研究采用基因定位方法來對bmr－6基因進(jìn)行了初步定位，為進(jìn)一步的基因精細(xì)定位奠定了基礎(chǔ)。同樣的方法也在高粱棕色中脈基因bmr－26的定位上被采用［14］。利用已有的分子圖譜對基因進(jìn)行初步定位，再以這一標(biāo)記為基點，進(jìn)行加密探針，可以大大的縮小標(biāo)記選擇的范圍，為目標(biāo)基因精細(xì)定位打下基礎(chǔ)［15］。本研究利用已公布的高粱分子圖譜中的SSR標(biāo)記，將棕色中脈基因直接定位到已知連鎖群上，為進(jìn)一步篩選引物和該基因精細(xì)定位打下了基礎(chǔ)，同時也為利用分子標(biāo)記輔助選擇進(jìn)行棕色中脈品種的選育創(chuàng)造了條件。

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