張艷麗 王寧萍 顧立剛 李澎濤 (寧夏醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)與免疫學(xué)系,銀川 750004)

甲型流感病毒(Influenza A virus)是一種引起最為常見(jiàn)和高傳染性人類疾病的病原體,分布于世界各地,在人類和動(dòng)物中具高致病率和死亡率,尤其是甲型H1N1流感,引起全世界的高度關(guān)注[1]。單核吞噬細(xì)胞是固有免疫的重要組成部分,在流感病毒感染的過(guò)程中,單核/巨噬細(xì)胞活化產(chǎn)生眾多種類的細(xì)胞因子,它們以網(wǎng)絡(luò)形式在調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中起著重要作用。其中有些細(xì)胞因子可刺激內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞釋放一氧化氮(NO)、氧自由基等炎性介質(zhì),導(dǎo)致組織損傷。有研究表明,NO對(duì)免疫系統(tǒng)有雙重作用,低水平的NO可參與免疫應(yīng)答的信息傳遞,而高水平NO則導(dǎo)致細(xì)胞毒作用,介導(dǎo)免疫損傷[2]。毒熱平注射液是根據(jù)中醫(yī)“毒損肺絡(luò)”的病機(jī)理論[3],結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)下呼吸道感染性疾病的認(rèn)識(shí)研制而成,有清熱解毒、涼血通絡(luò)的功效[4-6]。前期實(shí)驗(yàn)研究表明,毒熱平注射液對(duì)小鼠流感病毒性肺炎有抑制作用;可明顯降低流感病毒感染小鼠的死亡率[7,8]。本實(shí)驗(yàn)選用流感病毒亞甲型鼠肺適應(yīng)株FM1(H1N1)感染小鼠巨噬細(xì)胞株Ana-1,旨在觀察毒熱平對(duì)流感病毒感染巨噬細(xì)胞NF-κ B活性和分泌NO的影響,為該藥的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 流感病毒亞甲型鼠肺適應(yīng)株A/FM/1/47(H1N1),由中國(guó)中醫(yī)藥研究院中醫(yī)所提供,本實(shí)驗(yàn)室-76℃保存?zhèn)溆?。于九日齡雞胚尿囊腔連續(xù)傳代兩次后,測(cè)血凝滴度為1∶512。

1.1.2 細(xì)胞 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞株Ana-1購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司,由本室傳代后使用。

1.1.3 藥物 毒熱平注射液(DRP),由黃芩、梔子、燈盞花和豬膽粉四味藥物制成的中藥復(fù)方注射劑,棕色液體,含生藥17.4 g/L,由廣東康美藥業(yè)有限公司開(kāi)發(fā)提供(該藥目前尚在研發(fā)中)。

1.1.4 試劑 RPMI1640培養(yǎng)基,Gbico公司產(chǎn)品;新生牛血清購(gòu)自民海生物公司;生長(zhǎng)液:含10%新生牛血清的1640培養(yǎng)液;維持液:不含血清而含2 μ g/ml胰蛋白酶的 RPMI1640培養(yǎng)液;消化液:含0.5%胰蛋白酶和0.02%的乙二胺四乙酸(EDTA);引物及相關(guān)試劑由賽百盛生物公司合成提供;RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Fermentas公司;SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物公司;一抗:P65(sc-372),Santa cruz產(chǎn)品;二抗(抗兔)(ZB-2301)購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司;Griess試劑:A液為0.1%萘替乙二胺;B液為5%的磷酸加1%的磺胺,避光4℃保存?zhèn)溆?。使用時(shí),A液和B液1∶1混勻即可。

1.2 方法

1.2.1 小鼠巨噬細(xì)胞株Ana-1的培養(yǎng) 復(fù)蘇小鼠腹腔巨噬細(xì)胞Ana-1,將細(xì)胞混懸于生長(zhǎng)液中,37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),次日換液,3天后傳代1次,取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Ana-1細(xì)胞,消化液作用5分鐘后,棄去消化液,加入適量生長(zhǎng)液,吹打細(xì)胞,計(jì)數(shù)并調(diào)細(xì)胞濃度為3×106ml-1,移入24孔板,每孔加細(xì)胞懸液1 ml,貼壁培養(yǎng)4小時(shí)后棄去未貼壁的細(xì)胞。

1.2.2 病毒感染性測(cè)定(TCID50的測(cè)定) 用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液對(duì)流感病毒FM1行連續(xù)10倍遞次稀釋,將各稀釋度的病毒接種于3×106ml-1的Ana-1細(xì)胞中,每個(gè)稀釋度平行做6個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照。37℃吸附2小時(shí)后吸棄病毒液換用維持液繼續(xù)培養(yǎng),每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變效應(yīng),并記錄病變程度和孔數(shù),以細(xì)胞對(duì)照無(wú)明顯退變,病毒感染細(xì)胞病變率達(dá)50%及以上的細(xì)胞孔為病變孔,細(xì)胞病變率小于50%的為非病變孔,按Reed-Muench法計(jì)算病毒的TCID50(Median tissue culture infective dosage)。流感病毒FM1的 TCID50=10-4.3。

1.2.3 藥物細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)(MTT比色法) 待Ana-1細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),消化細(xì)胞,用生長(zhǎng)液調(diào)整細(xì)胞至所需濃度,將該細(xì)胞液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中 ,100 μ l/孔 ,于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至致密細(xì)胞單層。用維持液將DRP稀釋為不同濃度,加入細(xì)胞培養(yǎng)板中,100 μ l/孔,每個(gè)藥物稀釋濃度平行做3個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)后,用MTT(終濃度為0.5 mg/ml)比色法檢測(cè)藥物對(duì)Ana-1細(xì)胞的毒性,按Reed-Muench法計(jì)算藥物最大無(wú)毒濃度(TC0)和半數(shù)中毒濃度(TC50)。

1.2.4 DRP作用于病毒感染的巨噬細(xì)胞 用維持液稀釋100TCID50的流感病毒FM1株,0.5 ml/孔于37℃吸附單層Ana-1細(xì)胞1.5小時(shí)后,吸棄病毒液用溫浴的PBS清洗細(xì)胞2遍后,換用6個(gè)濃度的含藥維持液作為實(shí)驗(yàn)藥物組,分別為60 μ g/ml組、30 μ g/ml 組 、10 μ g/ml 組 、1 μ g/ml 組 、0.1 μ g/ml 組和0.01 μ g/ml組,同時(shí)設(shè)有正常細(xì)胞對(duì)照組和病毒對(duì)照組,每濃度3個(gè)復(fù)孔。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),分別作用6、12、24和36小時(shí)。

1.2.5 NO的測(cè)定 分別吸取孵育4個(gè)時(shí)間段的各孔細(xì)胞上清 100 μ l,加入 Griess試劑,100 μ l/孔 ,室溫顯色10分鐘,酶標(biāo)儀530 nm下測(cè)定各孔的A值。同時(shí),將1 μ g/ml組作用24小時(shí)的細(xì)胞培養(yǎng)板用封口膜封閉,迅速放入-76℃保存以備提取核蛋白。

1.2.6 測(cè)定NF-κ B p65的表達(dá) 嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明步驟提取巨噬細(xì)胞RNA和核蛋白。按購(gòu)自Fermentas公司的RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄 :20 μ l體系中含有 5 ×M-MLV buffer 4 μ l,dNTP 10 mmol,Rnasein 20 U,M-MLV 100 U,Oligo dT 20 pmol,RNA 1 μ g。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為:20℃5分鐘,42℃60分鐘,70℃5分鐘,冰浴冷卻后置-20℃保存。在ABI的PRISM 7700型熒光定量PCR儀上進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng),測(cè)定NF-κ B p65 mRNA 的表達(dá)(引物序列見(jiàn)表1):20 μ l PCR反應(yīng)體系中含 2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μ l,cDNA 2 μ l,上游引物 1 μ l,下游引物 1 μ l。PCR 擴(kuò)增條件為 95℃3 分鐘變性,94℃30秒,60℃30秒,72℃45秒;共 40個(gè)循環(huán),最后是72℃7分鐘延伸,擴(kuò)增完畢后對(duì)產(chǎn)物行凝膠電泳分析。

表1 NF-κ B p65的引物序列Tab.1 Primer for NF-κ B p65

采用 Western blot方法檢測(cè)DRP 1 μ g/ml作用于流感病毒感染巨噬細(xì)胞24小時(shí)后NF-κ B p65蛋白表達(dá)水平,內(nèi)參為β-actin。Image Tool凝膠分析軟件分析 Western blot電泳圖像,用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果以x—±s表示,采用t檢驗(yàn),P＜0.05為差異顯著,P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞狀態(tài)的觀察 于鏡下逐日觀察Ana-1細(xì)胞,正常細(xì)胞對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)正常、排列嚴(yán)密、貼壁緊;病毒對(duì)照組細(xì)胞24小時(shí)后開(kāi)始出現(xiàn)圓縮,失去原有形態(tài),且隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞開(kāi)始從瓶壁脫落,漂浮在培養(yǎng)液中。

2.2 藥物對(duì)細(xì)胞的毒性測(cè)定 檢測(cè)藥物的最大無(wú)毒濃度(TC0)為1.09 g/L,半數(shù)毒性濃度(TC50)為2.73 g/L。

2.3 藥物對(duì)病毒感染巨噬細(xì)胞分泌NO的影響

DRP 采用六個(gè)濃度:60、30、10、1、0.1 和 0.01 μ g/ml。分別作用于病毒感染的Ana-1細(xì)胞6、12、24和36小時(shí)。觀察其對(duì)病毒感染巨噬細(xì)胞釋放NO水平的影響,結(jié)果如表2。

結(jié)果顯示,不同濃度的DRP作用于病毒感染的巨噬細(xì)胞四個(gè)時(shí)間段,其中除0.1 μ g/ml濃度組作用6小時(shí)無(wú)抑制病毒感染巨噬細(xì)胞釋放NO的作用,其他各濃度組均有抑制作用,與病毒對(duì)照組有極顯著的差異。

2.4 NF-κ B p65 mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳 行Real Time PCR反應(yīng)前,首先要設(shè)計(jì)引物,因?yàn)橐镄蛄泻线m與否對(duì)于實(shí)驗(yàn)有決定性的作用。反應(yīng)完畢后對(duì)熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下掃描分析結(jié)果(見(jiàn)圖1)。

電泳結(jié)果表明,擴(kuò)增的基因片段長(zhǎng)度包括內(nèi)參β-actin均符合設(shè)計(jì)要求,結(jié)果與熒光定量PCR一致,說(shuō)明整個(gè)反應(yīng)體系準(zhǔn)確、可靠。

2.5 DRP對(duì)Ana-1細(xì)胞表達(dá)NF-κ B p65 mRNA 的影響 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出待測(cè)樣本目的基因mRNA的相對(duì)拷貝數(shù),與相對(duì)應(yīng)的β-actin的相對(duì)拷貝數(shù)比較,求出其mRNA表達(dá)水平。結(jié)果如表3所示。

表2 不同作用時(shí)間巨噬細(xì)胞上清NO含量的測(cè)定(A值,±s,n=6)Tab.2 Assay of NO secred by macrophages on different time treated with DRP(A value,±s,n=6)

表2 不同作用時(shí)間巨噬細(xì)胞上清NO含量的測(cè)定(A值,±s,n=6)Tab.2 Assay of NO secred by macrophages on different time treated with DRP(A value,±s,n=6)

Note:DRP groups compared with virus control group,1)P＜0.05,2)P＜0.01;Virus control group compared with cell control,1)P＜0.05,3)P＜0.001.

Group 6 h 12 h 24 h 36 h Cell control 0.021±0.001 0.038±0.008 0.036±0.004 0.061±0.019 Virus control 0.031±0.0043) 0.075±0.0613) 0.084±0.0063) 0.107±0.0121)60 μ g/ml 0.024±0.0042) 0.042±0.0131) 0.046±0.0092) 0.059±0.0012)30 μ g/ml 0.025±0.0052) 0.048±0.0052) 0.054±0.0121) 0.062±0.01052)10 μ g/ml 0.026±0.0042) 0.057±0.0081) 0.056±0.0121) 0.064±0.0092)1μ g/ml 0.030±0.0041) 0.059±0.0041) 0.060±0.0071) 0.067±0.0161)0.1 μ g/ml 0.034±0.007 0.069±0.011 0.064±0.0081) 0.074±0.0061)0.01 μ g/ml 0.042±0.015 0.098±0.031 0.072±0.0041) 0.084±0.0671)

圖1 mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳Fig.1 Electrophoretogram of mRNA amplification

表3 DRP作用24小時(shí)后NF-κ B p65 mRNA的表達(dá)(±s)Tab.3 The effect of DRP on expression of NF-κ B p65 mRNA treated for 24 h( ±s)

表3 DRP作用24小時(shí)后NF-κ B p65 mRNA的表達(dá)(±s)Tab.3 The effect of DRP on expression of NF-κ B p65 mRNA treated for 24 h( ±s)

Note:Cell control group compared with virus control group,1)P＜0.001;DRP group compared with virus control group,2)P＜0.01.

Groups NF-κ B p65 Cell control 0.072±0.003 Virus control 0.687±0.0051)DRP 1 μ g/ml 0.227±0.0072)

表4 DRP作用24小時(shí)后p65/β-actin灰度值的變化(±s,n=6)Tab.4 The change of p65/β-actin gray value on 24 h treated with DRP(±s,n=6)

表4 DRP作用24小時(shí)后p65/β-actin灰度值的變化(±s,n=6)Tab.4 The change of p65/β-actin gray value on 24 h treated with DRP(±s,n=6)

Note:Cell control group compared with virus control group,1)P＜0.001;DRP group compared with virus control group,2)P＜0.001.

Groups 24 h Cell control 0.070±0.004 Virus control 0.650±0.0031)DRP 1 μ g/ml 0.250 ±0.0022)

結(jié)果表明,DRP能明顯下調(diào)NF-κ B p65mRNA表達(dá)的水平。

2.6 DRP對(duì)Ana-1細(xì)胞表達(dá)NF-κ B p65的影響 用 Western blot的方法檢測(cè)DRP 1 μ g/ml作用于流感病毒感染巨噬細(xì)胞24小時(shí)后的巨噬細(xì)胞NF-κ B p65的表達(dá),同時(shí)用細(xì)胞骨架蛋白β-actin為內(nèi)參,檢測(cè)樣品的內(nèi)參量和p65蛋白量(表4)。

DRP作用24小時(shí)的p65/β-actin變化顯示,病毒對(duì)照組與細(xì)胞對(duì)照組NF-κ B p65蛋白表達(dá)量差異極顯著,DRP 1 μ g/ml組能明顯下調(diào)流感病毒感染的巨噬細(xì)胞NF-κ B p65蛋白的表達(dá)。

3 討論

在流感病毒感染的過(guò)程中,單核/巨噬細(xì)胞活化產(chǎn)生眾多種類的細(xì)胞因子,它們以網(wǎng)絡(luò)形式在調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中起著重要作用。故本研究建立病毒感染的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞模型來(lái)觀察DRP抗流感病毒的部分機(jī)制。

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)有三種NO合成酶。其中,誘導(dǎo)性NO合成酶(iNOS)表達(dá)不依賴細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化,且通常情況下不表達(dá)。但在細(xì)菌、病毒或內(nèi)毒素 、TNF-α、IFN-γ、IL-1 等細(xì)胞因子刺激下,巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、血管平滑肌及肝細(xì)胞等組織細(xì)胞內(nèi)iNOS表達(dá)顯著增高,釋放大量NO,激發(fā)幾種不利的細(xì)胞反應(yīng)而導(dǎo)致炎癥和休克[9,10];且iNOS誘導(dǎo)的NO產(chǎn)生的水平能反映機(jī)體的炎癥程度。在本實(shí)驗(yàn)中,病毒感染的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO水平顯著高于未被病毒感染的細(xì)胞,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),NO釋放水平逐漸增高;不同濃度的DRP作用不同的時(shí)間,均能下調(diào)NO水平。NF-κ B介導(dǎo)NO對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)過(guò)程。靜息狀態(tài)下,NF-κ B與NF-κ B抑制蛋白Iκ Bα結(jié)合,存在于細(xì)胞漿中。許多的外源性刺激如內(nèi)毒素、多種細(xì)胞因子等均可使 Iκ Bα磷酸化,從而與NF-κ B 分離 ,使 NF-κ B 活化,移位至細(xì)胞核內(nèi),繼之與炎癥細(xì)胞因子基因的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合,啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄,這些基因產(chǎn)物就可啟動(dòng)和調(diào)節(jié)固有免疫,并誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫的產(chǎn)生。參與調(diào)節(jié)多種促炎細(xì)胞因子的合成,在早期發(fā)揮抗病毒作用。但是,炎癥因子和趨化因子的過(guò)度表達(dá)還會(huì)損傷組織,加重流感病毒所致的病理改變,如肺損傷,促進(jìn)病情的進(jìn)一步發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)用 Western blot方法測(cè)定1 μ g/ml DRP作用于流感病毒感染的巨噬細(xì)胞24小時(shí),觀察其核因子NF-κ B p65蛋白的變化。結(jié)果表明DRP確能顯著下調(diào)病毒活化巨噬細(xì)胞核因子NF-κ B p65蛋白的表達(dá),與該藥下調(diào)核因子NF-κ B p65 mRNA表達(dá)水平相一致。本研究證實(shí),DRP能下調(diào)病毒活化巨噬細(xì)胞核因子NF-κ B p65的表達(dá);調(diào)節(jié)病毒感染后巨噬細(xì)胞釋放NO在適量水平,抑制巨噬細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子的釋放,限制炎癥介質(zhì)對(duì)組織器官的損害,減緩炎性病變,控制病情的發(fā)展。究其如何影響NF-κ B信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性,本實(shí)驗(yàn)室將在后面的研究中進(jìn)一步探討。

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