李德憲 張?zhí)焱?譚守勇 張賢蘭 (中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院呼吸科,廣州 510630)

宿主受結(jié)核分枝桿菌感染后近期內(nèi)發(fā)病乃至以后發(fā)病者僅約10%,且發(fā)病者臨床表現(xiàn)差異極大,宿主感染后發(fā)病與否,及發(fā)病的嚴(yán)重程度等,不僅與感染的細(xì)菌量及其毒力等因素有關(guān),而且還取決于機(jī)體的免疫功能。目前認(rèn)為機(jī)體的抗結(jié)核免疫反應(yīng)主要是通過(guò)T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)巨噬細(xì)胞效應(yīng)的細(xì)胞免疫反應(yīng),CD4+T細(xì)胞按細(xì)胞因子產(chǎn)生的模式和生物功能可分為T(mén)h1細(xì)胞和Th2細(xì)胞。為探討:外周血的Th1和Th2細(xì)胞與肺結(jié)核病變嚴(yán)重程度的關(guān)系;抗結(jié)核治療前后外周血的Th1和Th2細(xì)胞的變化;外周血的Th1和Th2細(xì)胞及其變化與療效的關(guān)系;我們進(jìn)行此研究。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 肺結(jié)核患者組:共62例,其中男48例,女14例,年齡 16～88 歲,平均 50.24±20.45歲 。所有患者均符合《肺結(jié)核診斷和治療指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1],均具有細(xì)菌學(xué)或病理學(xué)陽(yáng)性依據(jù)。本組肺結(jié)核患者無(wú)合并糖尿病、艾滋病、甲狀腺功能亢進(jìn)及其他自身免疫性疾病,治療前未使用免疫調(diào)節(jié)劑。肺部病灶受累程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):局限病變是指肺部病灶累及范圍少于或等于2個(gè)肺野;多葉受累是指肺部病灶累及范圍多于2個(gè)肺野。療效判斷標(biāo)準(zhǔn):明顯吸收是指治療后病灶吸收或縮小大于或等于50%以上;吸收不明顯是指治療后病灶吸收或縮小不足50%;惡化是指治療后病灶范圍較前擴(kuò)大。62例肺結(jié)核患者中,局限組20例(單側(cè)局限13例,雙側(cè)局限7例),其中空洞形成5例(25.0%);多葉受累組42例(單側(cè)多葉4例,雙側(cè)多葉38例),其中空洞形成30例(71.4%)。治療后24例病灶明顯吸收好轉(zhuǎn),38例病灶吸收不明顯。

健康對(duì)照組:共30例,其中男19例、女11例,年齡16～50歲,平均34.10±8.11歲。為影像學(xué)正常及近期無(wú)接觸結(jié)核病史的正常體檢者,PPD皮試為陰性或一般陽(yáng)性,血清抗結(jié)核抗體陰性。

1.2 研究方法 患者入院一周內(nèi)進(jìn)行一下檢查:痰涂片找抗酸桿菌及痰結(jié)核菌培養(yǎng);采集外周血查血常規(guī)、血沉(ESR)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)及Th細(xì)胞亞群檢測(cè);胸部X-線(xiàn)照片(或)胸部CT檢查。明確診斷后,接受規(guī)則抗結(jié)核治療(應(yīng)用異煙肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇或鏈霉素四藥聯(lián)合治療),治療過(guò)程不使用免疫調(diào)節(jié)劑,抗結(jié)核治療2月后復(fù)查(項(xiàng)目與入院時(shí)檢查相同)。

Th細(xì)胞亞群檢測(cè):采用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子測(cè)定法,以胞內(nèi)INF-γ的表達(dá)代表Th1細(xì)胞,IL-4的表達(dá)代表Th2細(xì)胞進(jìn)行分型,通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定。XL-4型流式細(xì)胞儀為Beckman Coulter公司產(chǎn)品;TC2323 CO2培養(yǎng)箱為SL公司產(chǎn)品。主要熒光標(biāo)記單克隆抗體:及相應(yīng)的同型對(duì)照,以及檢測(cè)抗體所用的絕對(duì)計(jì)數(shù)微球、破膜及固定劑均為Immunotech公司產(chǎn)品;佛波酯、離子霉素、莫能霉素、二甲亞砜、含鏈霉素青霉素磷酸鹽緩沖液等為Sigma公司產(chǎn)品;1640培養(yǎng)液、滅活胎牛血清為Gibco Bre公司產(chǎn)品。嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)要求操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析;計(jì)量資料采用±s表示平均水平,兩樣本均數(shù)的比較用t檢驗(yàn),治療前后計(jì)量資料變化的比較用配對(duì) t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料的比較用 χ2檢驗(yàn);P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 治療前肺結(jié)核組與健康對(duì)照組的Th1和Th2細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 見(jiàn)表1,肺結(jié)核組的Th1和Th2細(xì)胞的計(jì)數(shù)均明顯低于對(duì)照組。

表1 治療前肺結(jié)核組與健康對(duì)照組的Th1和Th2細(xì)胞計(jì)數(shù)比較Tab.1 Comparison of Th1 cell count and Th2 cell count between tuberculosis group and controls before antituberculosis therapy

表2 治療前不同程度肺部病灶受累組肺結(jié)核患者的臨床特征比較Tab.2 Comparison of characteristics between diffuse group and limited group before antituberculosis therapy

2.2 治療前不同程度肺部病灶受累組肺結(jié)核患者的臨床特征比較 見(jiàn)表2,多葉受累組的血沉高于局限組,血紅蛋白及Th1細(xì)胞計(jì)數(shù)均低于局限組。另外,無(wú)論是多葉受累組還是局限組的Th1細(xì)胞計(jì)數(shù)和Th2細(xì)胞計(jì)數(shù)均低于健康對(duì)照組,其中Th1細(xì)胞計(jì)數(shù)在多葉受累組、局限組與健康對(duì)照組中呈逐漸增多趨勢(shì)。

2.3 治療前病灶吸收明顯組與病灶吸收不明顯組的臨床特征比較 見(jiàn)表3,治療前兩組的Th1、Th2細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、血沉和C-反應(yīng)蛋白均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但Th1和Th2細(xì)胞計(jì)數(shù)均較健康組低。

2.4 治療后病灶吸收明顯組與病灶吸收不明顯組的臨床特征比較 見(jiàn)表4,治療后病灶吸收明顯組的血沉和C-反應(yīng)蛋白均低于病灶吸收不明顯組,病灶吸收明顯組的Th1細(xì)胞計(jì)數(shù)恢復(fù)至健康水平,病灶吸收不明顯組的Th1細(xì)胞計(jì)數(shù)仍低于健康水平,兩組Th2細(xì)胞計(jì)數(shù)仍均低于健康組。

2.5 病灶吸收明顯組治療前后的臨床特征比較

見(jiàn)表5,治療后除血紅蛋白、血沉和C-反應(yīng)蛋白明顯改善外,Th1細(xì)胞計(jì)數(shù)亦較治療前有明顯增加,且與健康對(duì)照組比較無(wú)差異;Th2細(xì)胞計(jì)數(shù)則治療前后相似,仍低于健康對(duì)照組。

2.6 病灶吸收不明顯組治療前后的的臨床特征比較 見(jiàn)表6,治療后雖然白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血沉和C-反應(yīng)蛋白較前有改善,但血紅蛋白改變不大,且仍顯著低于健康組;Th1細(xì)胞計(jì)數(shù)雖較前有明顯增加,但仍顯著低于健康對(duì)照組;Th2細(xì)胞計(jì)數(shù)則較治療前有降低,明顯低于健康組。

表3 治療前病灶吸收明顯組與病灶吸收不明顯組的的臨床特征比較Tab.3 Comparison of characteristics between improved group and stable group before antituberculosis therapy

表4 治療后病灶吸收明顯組與病灶吸收不明顯組的臨床特征比較Tab.4 Comparison of characteristics between improved group and stable group after two months of antituberculosis therapy

表5 病灶吸收明顯組治療前后的臨床特征比較(n=24)Tab.5 Comparison of characteristics before and after two months of antituberculosis therapy in improved group(n=24)

表6 病灶吸收不明顯組治療前后的臨床特征比較(n=38)Tab.6 Comparison of characteristics before and after two months of antituberculosis therapy in stable group(n=38)

表7 病灶吸收明顯組與病灶吸收不明顯組前后的臨床特征變化的比較Tab.7 Comparison of characteristics before and after therapybetween improved group and stable group

2.7 病灶吸收明顯組與病灶吸收不明顯組治療前后的臨床特征變化比較 見(jiàn)表7,病灶吸收明顯組的Th1細(xì)胞計(jì)數(shù)的增加值顯著較病灶吸收不明顯組多,Th2細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、血沉、C-反應(yīng)蛋白的變化值則相似。

3 討論

傳統(tǒng)上,肺結(jié)核肺部病灶受累程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)通常依據(jù)影像學(xué)上是否形成空洞病灶而劃分,如同是菌陰肺結(jié)核,有空洞者治療療程則須相應(yīng)延長(zhǎng)。有關(guān)肺結(jié)核病變的病理形成過(guò)程現(xiàn)已較明確,空洞是否出現(xiàn)是感染細(xì)菌的數(shù)量、毒力及機(jī)體免疫功能共同作用的結(jié)果,機(jī)體免疫力嚴(yán)重缺乏時(shí),并不形成空洞,如艾滋病患者合并肺結(jié)核,多出現(xiàn)中下肺廣泛播散灶,但少見(jiàn)空洞形成,又如臨床上認(rèn)為較危重的血行播散型肺結(jié)核也少見(jiàn)空洞形成,可見(jiàn)以空洞形成與否作為肺結(jié)核嚴(yán)重性的判斷標(biāo)準(zhǔn)存在不足。我們認(rèn)為,由于結(jié)核病免疫反應(yīng)具有不平衡性,在不同的肺葉,甚至同一肺葉乃至同一病變的不同部位可以同時(shí)存在處于不同病程的病變的特點(diǎn),以肺部病灶累及范圍多少作為肺結(jié)核嚴(yán)重性的判斷標(biāo)準(zhǔn)更趨合理,此外以病灶播散程度來(lái)探討外周血中細(xì)胞的免疫功能也更科學(xué)。在我們研究的所有62例肺結(jié)核患者中,影像學(xué)顯示有空洞形成者35例,未見(jiàn)空洞者27例,按我們標(biāo)準(zhǔn)劃分,局限組20例,其中空洞形成5例(25.0%),多葉受累組42例,其中空洞形成30例(71.4%),多葉受累組空洞形成明顯高于局限組,兩組差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001,χ2檢驗(yàn))。由于影像學(xué)觀察容易出現(xiàn)因閱片者不同而出現(xiàn)差異,為驗(yàn)證我們的影像學(xué)分度的準(zhǔn)確性,我們同時(shí)比較不同肺部病灶受累程度患者的血紅蛋白、C-反應(yīng)蛋白和血沉,結(jié)果如表2所示,多葉受累組的血紅蛋白109.83±25.06(g/L)明顯低于局限組的128.95±17.29(g/L),血沉82.60±42.74(mm/h)明顯高于局限組的42.50±32.99(mm/h),C-反應(yīng)蛋白67.14±65.33(mg/L)也高于局限組的42.01±68.74(mg/L),證實(shí)影像學(xué)結(jié)果與臨床表現(xiàn)的一致性。

自1986年Mosmann等[2]發(fā)現(xiàn),小鼠CD4+T細(xì)胞按細(xì)胞因子產(chǎn)生的模式和生物功能,有兩種極不相同的亞群,分別稱(chēng)為T(mén)h1細(xì)胞和Th2細(xì)胞以來(lái),有關(guān)Th1/Th2的平衡與結(jié)核病的關(guān)系成為研究的熱點(diǎn)。由于研究樣本的種屬差異、個(gè)體差異、不同發(fā)病時(shí)期、不同嚴(yán)重程度、不同研究方法等,研究結(jié)果存在爭(zhēng)議,具體表現(xiàn)為同是外周血或同是病變部位的研究結(jié)果的不一致性,以及病變部位與外周血表現(xiàn)的差異。如在外周血研究方面,Zhang等[3]報(bào)道結(jié)核病人的外周血細(xì)胞的Th1反應(yīng)型并不伴隨Th2反應(yīng)增高;但Surcel等[4]報(bào)道活動(dòng)性肺結(jié)核患者以Th2樣細(xì)胞數(shù)量增多為主,Th1細(xì)胞未見(jiàn)減少。Lienhardt等[5]報(bào)道了大樣本臨床研究結(jié)果,提示:外周血較低下的Th1型反應(yīng)和/或更強(qiáng)的Th2型反應(yīng)者,患結(jié)核風(fēng)險(xiǎn)更高;上調(diào)Th1型反應(yīng)可能有助于提高抗結(jié)核療效。Handzel等[6]則認(rèn)為急性結(jié)核病外周血Th1和Th2型反應(yīng)均增強(qiáng)。Sahiratmadja等[7]發(fā)現(xiàn)活動(dòng)性結(jié)核組的Th1型反應(yīng)明顯低于對(duì)照組,且與疾病嚴(yán)重程度緊密關(guān)聯(lián),病情越嚴(yán)重則Th1型反應(yīng)越低,治療后Th1型反應(yīng)可恢復(fù)至接近正常水平,結(jié)核組的Th2型反應(yīng)則治療前稍高于對(duì)照組,治療后則降低至對(duì)照組水平。

由于結(jié)核病免疫反應(yīng)具有不平衡性,在不同的肺葉,甚至同一肺葉乃至同一病變的不同部位可以同時(shí)存在處于不同病程的病變,因此,我們認(rèn)為外周血液可能更能反映機(jī)體總體免疫狀況。另外,不同的發(fā)病時(shí)期,機(jī)體免疫反應(yīng)也不相同,我們采用抗結(jié)核治療前后不同時(shí)期的動(dòng)態(tài)比較可更好解決不同疾病時(shí)期免疫應(yīng)答可能不同的問(wèn)題。細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子測(cè)定能更直接、更準(zhǔn)確地反映體內(nèi)Th1及Th2細(xì)胞的實(shí)際情況。因此,本研究采用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子測(cè)定法,以胞內(nèi)INF-γ的表達(dá)代表Th1細(xì)胞,IL-4的表達(dá)代表Th2細(xì)胞進(jìn)行分型,通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù),對(duì)不同嚴(yán)重程度的結(jié)核病患者及治療前后不同時(shí)期的外周血液進(jìn)行Th細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)研究結(jié)核病患者Th1/Th2細(xì)胞免疫應(yīng)答失調(diào)與臨床病變嚴(yán)重程度、疾病轉(zhuǎn)歸、預(yù)后的關(guān)系。

本研究顯示,治療前肺結(jié)核患者Th1細(xì)胞計(jì)數(shù)低于健康者,而且肺部病灶受累程度越嚴(yán)重,Th1細(xì)胞計(jì)數(shù)則越低;治療后,肺部病灶吸收明顯者,Th1細(xì)胞計(jì)數(shù)升高得多,達(dá)到甚至超過(guò)健康水平,而病灶吸收不明顯者的Th1細(xì)胞計(jì)數(shù)雖然較治療前有明顯增加,但仍低于健康水平。與Zhang等[3]及Lienhardt等[5]的大型臨床研究報(bào)道一致。尤其是Lienhardt等的研究,雖然研究方法及選用的Th1型因子與本研究不同,但其研究也表明Th1型反應(yīng)低下與結(jié)核病的發(fā)生有關(guān),而且低下的Th1型反應(yīng)在有效抗結(jié)核治療后出現(xiàn)明顯增加,甚至超過(guò)正常對(duì)照組,但兩者也存在一定區(qū)別,Lienhardt等研究顯示Th1型反應(yīng)恢復(fù)性增加值達(dá)到甚至超過(guò)正常對(duì)照組的時(shí)間需在抗結(jié)核后6個(gè)月,而本研究?jī)H需2個(gè)月,還有Lienhardt等是所有入選肺結(jié)核患者(無(wú)論治療反應(yīng)如何)的平均反應(yīng),未對(duì)患者作進(jìn)一步分層分析,而本研究顯示,并非所有肺結(jié)核病人經(jīng)過(guò)抗結(jié)核治療后均可出現(xiàn)此反應(yīng),只有療效明顯者才會(huì)出現(xiàn)此變化,療效不明顯者Th1細(xì)胞計(jì)數(shù)雖然較治療前有明顯增加,但仍低于健康水平,推測(cè)結(jié)核病的發(fā)生和進(jìn)展可能與Th1細(xì)胞低下有關(guān),成功的抗結(jié)核治療后,Th1細(xì)胞隨之恢復(fù),上調(diào)Th1型反應(yīng)可能有助于提高抗結(jié)核療效。

有關(guān)Th2細(xì)胞方面,本研究顯示,治療前肺結(jié)核患者無(wú)論肺部病灶受累廣泛與否,Th2細(xì)胞計(jì)數(shù)均低于健康對(duì)照組,差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而且病情輕重患者間Th2細(xì)胞計(jì)數(shù)并無(wú)差異;治療后,低水平的Th2細(xì)胞計(jì)數(shù)并不回升,在病灶吸收不明顯患者中甚至出現(xiàn)進(jìn)一步下降趨勢(shì)。與Zhang等[3]及Lienhardt等[5]研究Th1型反應(yīng)低下但Th2型反應(yīng)相似或升高不同,可能與研究方法不同有關(guān),Zhang等[3]及Lienhardt等[5]研究采用細(xì)胞外細(xì)胞因子測(cè)定方法,本研究采用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子測(cè)定法。Lin等[8]用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法測(cè)定外周血及淋巴結(jié)內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)的研究均提示結(jié)核病發(fā)病是以Th1型免疫反應(yīng)低下為主,而非Th2型免疫反應(yīng)增強(qiáng),本研究這進(jìn)一步證實(shí)這一發(fā)病機(jī)理。推測(cè)治療后好轉(zhuǎn)明顯患者,由于Th1細(xì)胞上升,有足夠的Th1型免疫保護(hù),為維持Th1/Th2平衡,Th2細(xì)胞亦出現(xiàn)輕微的上調(diào);而病灶吸收不良患者,由于治療后雖然Th1細(xì)胞較前有一定升高,但仍遠(yuǎn)低于健康者,為維持足夠的Th1型免疫保護(hù)機(jī)體,而下調(diào)Th2細(xì)胞。

綜上所述,我們認(rèn)為,結(jié)核病的發(fā)生和進(jìn)展可能與Th1細(xì)胞低下有關(guān),而非Th2型免疫反應(yīng)增強(qiáng)所致,成功的抗結(jié)核治療后,Th1細(xì)胞隨之恢復(fù)。然而,免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子的作用是復(fù)雜的和多方面的,在機(jī)體不同的狀態(tài)時(shí),它們所起的作用也不相同,并且能夠被很多物質(zhì)調(diào)節(jié)。目前,細(xì)胞因子的作用尚未徹底明了,相信隨著研究的深入,將有助于在抗結(jié)核治療中引入新的特異性免疫治療。

1 中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)分會(huì).肺結(jié)核診斷和治療指南[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2001;24(1):70-74.

2 Mosmann T R,Chewinski H,Bond M W et al.Two types of murine helper T cell clone.I.Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins[J].J Immunol,1986;136(7):2348-2357.

3 Zhang M,Lin Y,Dinakar V et al.T cell cytokine responses in human infection with mycobacterium tuberculosis[J].Infection and Immunity,1995;63(8):3231-3234.

4 Surcel HM,Troye-Blomberg M,Paulie S et al.Th1/Th2 profilesintuberculosis,based on the proliferation and cytokine response of blood lymphocytes to mycobacterial antigens[J].Immunology,1994;81(2):171-176.

5 Lienhardt C,Azzurri A,Amedei A et al.Active tuberculosis in Africa is associated with reduced Th1 and increased Th2 activity in vivo[J].Eur J Immunol,2002;32(6):1605-1613.

6 Handzel Z T,Barak V,Altman Y et al.Increased Th1 and Th2 type cytokine production in patients with active tuberculosis[J].Isr Med Assoc J,2007;9(6):479-483.

7 Sahiratmadja E,Alisjahbana B,de Boer T et al.Dynamic changes in proand anti-inflammatory cytokine profiles and gamma interferon receptor signaling integrity correlate with tuberculosis disease activity and response to curative treatment[J].Infect Immun,2007;75(2):820-829.

8 Lin Y,Zhang M,Hofman F M et al.Absence of a prominent Th2 cytokine response in human tuberculosis[J].Infect Immun,1996;64(6):1351-1356.