鄧日輝 陳 穎 黃 羽 孫 靜 何 敏 周 丹 曾 星 陳曲波

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院免疫室,廣州 510120)

原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)是一種慢性炎癥性、進(jìn)行性肝內(nèi)膽汁淤積性自身免疫性肝病[1]。該病女性多發(fā),與患者體內(nèi)產(chǎn)生抗線粒體抗體(AMA)特別是其M2亞型密切相關(guān),確切病因至今不明[2]。Th17細(xì)胞是近年發(fā)現(xiàn)的以分泌白介素17(IL-17)為主要特征的新的CD4+T細(xì)胞亞型,在自身免疫疾病和感染性疾病中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[3]。新近發(fā)現(xiàn)PBC患者肝組織中Th17細(xì)胞明顯高于健康人群[4],Th17細(xì)胞過度增殖的確切機(jī)制還不清楚。國外報(bào)道體外誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化與多種細(xì)胞因子密切相關(guān),特別是 IL-1β、IL-6和 IL-23等在誘導(dǎo)時(shí)起到十分關(guān)鍵的作用[5,6]。這些細(xì)胞因子是否影響PBC患者Th17細(xì)胞的分化,目前尚未見報(bào)道。為此,我們從PBC患者和正常人外周血中分離初始T細(xì)胞,通過在體外培養(yǎng)中加入IL-1β、IL-6和IL-23,觀察這些細(xì)胞因子對(duì)PBC患者初始T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化的影響,并與正常人初始T細(xì)胞的分化進(jìn)行比較,為揭示Th17細(xì)胞形成與PBC的相關(guān)性提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 PBC患者15例,女性13例,男性2例,平均年齡(51.2±8.6)歲,均為2008年7月-2009年9月來廣東省中醫(yī)院或中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院就診的PBC患者,在采血前均未用過糖皮質(zhì)激素類、熊去氧膽酸及其他免疫抑制/增強(qiáng)劑治療。PBC的診斷按照2000年美國肝臟病研究協(xié)會(huì)推薦的PBC診治標(biāo)準(zhǔn):(1)肝內(nèi)淤膽的臨床癥狀和體征,肝功能指標(biāo)異常,特別是膽汁淤積的證據(jù);(2)腹部B超、CT或逆行胰膽管造影排除其他膽道梗阻因素;(3)血清抗線粒體抗體(AMA)≥1∶1 000且AMAM2陽性。同時(shí)以20例健康獻(xiàn)血者為對(duì)照組,年齡、性別與PBC組匹配,其中女性17例,男性3例,平均年齡(48.5±9.7)歲,均無肝臟相關(guān)疾病及自身免疫性疾病病史。

1.2 試劑與儀器 人初始CD4+T細(xì)胞磁珠分選試劑盒、磁力架、抗人PE-CD45RA均購自德國Miltenyi公司。IL-6、IL-1β購自 Peprotech公司。IL-23購自R&D 公司 。Anti-CD3、anti-CD28、anti-IFN-γ、anti-IL-4,抗人 FITC-CD4、抗人 PE-IL-17、PMA、Inomycin、cell staining buffer、破膜劑和固定劑均購自Biolegend公司。Monensin為Merck公司產(chǎn)品。RPMI1640培養(yǎng)液購自Gibco公司。葡聚糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)購自上海華精生物科技公司。流式細(xì)胞檢測(cè)儀(FC-500)及其流式結(jié)果分析軟件CXP均為Beckman Coulter公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的獲取 取正常人和PBC患者靜脈血,肝素抗凝。PBS等倍稀釋,充分混勻后等體積加到葡聚糖-泛影葡胺液面,離心(2 000 r/min,20分鐘)。吸出PBMC后再充分洗滌(1 500 r/min,10分鐘),最后用PBS調(diào)整PBMC密度為2×109L-1。

1.3.2 初始T細(xì)胞分選及純度確定 取PBS+BSA+EDTA緩沖液重懸PBMC,嚴(yán)格按Miltenyi公司磁珠分選試劑盒說明書進(jìn)行操作,經(jīng)FITC-CD4和PE-CD45RA表面染色后行FCM檢測(cè),CXP軟件分析表明,經(jīng)免疫磁珠技術(shù)分選的初始T細(xì)胞純度能大于98%。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將初始T細(xì)胞以1×109L-1的密度分4組培養(yǎng)在48孔培養(yǎng)板中,每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔,每孔 500 μ l,培養(yǎng)第 1天起在各孔均加入 anti-CD3、anti-CD28和 anti-IL-4、anti-IFN-γ作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基后,4組再各自加入不同的細(xì)胞因子進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng):①不加任何細(xì)胞因子為空白對(duì)照組;②IL-1β組;③IL-1β+IL-6組;④IL-1β+IL-6+IL-23組。于37℃、50 mL/L CO2孵箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),隔3 d換液一次,并及時(shí)補(bǔ)充相應(yīng)的細(xì)胞因子,培養(yǎng)9 d后在刺激劑PMA、Inomycin與monensin的刺激下繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí),收集培養(yǎng)后之細(xì)胞用于FCM檢測(cè)。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 將上述收集的培養(yǎng)后細(xì)胞,離心洗滌(1 500 r/min,5分鐘)制成細(xì)胞懸液,加入抗人FITC-CD4抗體表面染色,室溫避光孵育30分鐘,洗滌(1 500 r/min,5分鐘),固定破膜,加入抗人PE-IL-17抗體胞內(nèi)染色,室溫避光孵育30分鐘,離心洗滌(1 500 r/min,5分鐘),cell staining buffer重懸后行FCM檢測(cè),CXP軟件分析各自Th17細(xì)胞分化頻率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)包,所有數(shù)據(jù)用中位數(shù)(四分位間距)[M(Q)]表示,兩組間比較采用Wilcox符號(hào)秩和檢驗(yàn),多組間比較采用Friedman秩和檢驗(yàn),多組間的兩兩比較采用Bonferroni法,檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 空白組 在僅加入 anti-CD3、anti-CD28和anti-IL-4、anti-IFN-γ培養(yǎng)時(shí),正常人及PBC患者的初始T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化的頻率均很低(＜1%)。

2.2 IL-1β組 在基礎(chǔ)培養(yǎng)劑條件下加入IL-1β共培養(yǎng)時(shí),經(jīng)FCM檢測(cè)發(fā)現(xiàn):Th17細(xì)胞分化頻率顯著高于空白對(duì)照組,兩組有顯著性差異(P＜0.01)。

2.3 IL-1β+IL-6組 在基礎(chǔ)培養(yǎng)劑條件下同時(shí)加入IL-1β和IL-6共培養(yǎng)后,Th17細(xì)胞分化頻率明顯高于未加細(xì)胞因子的空白對(duì)照組(P＜0.01);但I(xiàn)L-1β+IL-6組與IL-1β組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

2.4 IL-1β+IL-6+IL-23組 在基礎(chǔ)培養(yǎng)劑條件下將IL-1β、IL-6、IL-23同時(shí)加入后共培養(yǎng),PBC患者初始T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞效果達(dá)到最佳,明顯高于其它各組,差異有顯著性差異(P＜0.01,見表1),PBC患者4組培養(yǎng)條件下Th17細(xì)胞分化FCM結(jié)果見圖1。

圖1 細(xì)胞因子對(duì)PBC患者初始T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞的誘導(dǎo)作用Fig.1 The effectiveness of different cytokines induce Na ?ve T cells of PBC patients differentiating into Th17 cells

表1 不同細(xì)胞因子組誘導(dǎo)PBC患者Th17細(xì)胞分化[M(Q),n=15]Tab.1 The frequency of Th17 cells differentiation in PBC patients induced by different cytokines[M(Q),n=15]

表2 4種誘導(dǎo)條件下兩組Th17細(xì)胞分化頻率比較(M(Q),正常人n=20,PBC n=15)Tab.2 The frequency of Th17 cells differentiation between PBCpatients and normol induced under 4 conditions[M(Q),Normal n=20,PBC n=15]

2.5 PBC患者與正常人Th17細(xì)胞分化的差異PBC患者與正常人初始T細(xì)胞在相同條件下分組進(jìn)行培養(yǎng)后,FCM檢測(cè),經(jīng)CXP軟件分析發(fā)現(xiàn):IL-1β+IL-6+IL-23組促使正常人和PBC患者Th17細(xì)胞分化效果均達(dá)到最佳,但PBC患者Th17細(xì)胞分化效果明顯高于正常人,兩者有顯著性差異(P＜0.01);但兩組人群的 IL-1β組或 IL-1β+IL-6組,其初始T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化的效果均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05),組間比較見表2。

3 討論

由于IFN-γ在自身免疫疾病發(fā)病高峰期病變部位的高表達(dá),使得分泌IFN-γ的Th1細(xì)胞被看作是引起自身免疫性疾病的關(guān)鍵因素。后發(fā)現(xiàn)IFN-γ缺陷性小鼠也具有對(duì)多種自身免疫疾病高度易感性,推測(cè)存在一種Th1以外的效應(yīng)性T細(xì)胞介導(dǎo)了自身免疫疾病[7]。新近發(fā)現(xiàn),有一群以分泌IL-17為特征的,不同于 Th1、Th2的 CD4+T細(xì)胞,即 Th17細(xì)胞,它由初始T細(xì)胞分化而來,并具有獨(dú)立的分化和發(fā)育機(jī)制[8]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),Th17細(xì)胞的分化受多種細(xì)胞因子調(diào)控。小鼠體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?TGF-β和IL-6聯(lián)用可誘導(dǎo)Th17分化[9]。也有報(bào)道稱細(xì)胞因子IL-23能促進(jìn)人Th17細(xì)胞的增殖并維持Th17細(xì)胞的活性[5]。

原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)是一種自身免疫性膽汁淤積性肝病,以存在抗線粒體抗體和強(qiáng)烈膽管炎癥反應(yīng)為特征。與正常人相比,PBC患者肝組織Th17細(xì)胞顯著增高,表明發(fā)炎的肝臟細(xì)胞微環(huán)境更易誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的產(chǎn)生[4]。Annunziato等[10]發(fā)現(xiàn)IL-6能誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分泌IL-17,與PBC發(fā)病密切相關(guān)。國外有報(bào)道稱Th17細(xì)胞分化與多種細(xì)胞因子密切相關(guān),特別是IL-1β、IL-6和IL-23等起到十分關(guān)鍵作用[5,6]。而細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6與 IL-23)能否誘導(dǎo)PBC患者Th17細(xì)胞的分化,且不同細(xì)胞因子刺激下PBC患者Th17細(xì)胞分化是否有差異,尚未見報(bào)道。因此,我們著手研究PBC患者Th17細(xì)胞的分化條件及與正常人Th17細(xì)胞分化差異,觀察這些細(xì)胞因子對(duì)PBC患者初始T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化的影響,以初步探討Th17細(xì)胞分化與PBC疾病的潛在聯(lián)系,為進(jìn)一步揭示PBC的發(fā)病機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

IL-1β是Th17早期分化關(guān)鍵的細(xì)胞因子,是Th17細(xì)胞及Th17細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫早期編程的關(guān)鍵T細(xì)胞信號(hào)[6]。本研究中,我們采用免疫磁珠分選技術(shù)(MACS)從PBC患者和正常人外周血中分選出初始T細(xì)胞,培養(yǎng)時(shí)各孔均加入T細(xì)胞分化抗體anti-CD3、anti-CD28和中和抗體anti-IL-4、anti-IFN-γ(阻斷初始T細(xì)胞向Th1、Th2分化),并在加入不同細(xì)胞因子的條件下分組培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)未加入細(xì)胞因子的空白對(duì)照組Th17細(xì)胞分化頻率很低(＜1%);而IL-1β組Th17細(xì)胞的分化頻率明顯增高,說明IL-1β顯著促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化;與IL-1β組相比,IL-1β+IL-6組Th17細(xì)胞分化效果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05),我們推測(cè)在誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化時(shí),IL-6并未起到關(guān)鍵的作用。

IL-23對(duì)Th17細(xì)胞分化的影響,是近年來研究熱點(diǎn)。但它在Th17細(xì)胞分化中的作用迄今尚未明確。IL-23是IL-12異二聚體細(xì)胞因子家族中的一員,除與IL-12一樣擁有共同p40亞單元外還含獨(dú)特的p19亞單元,IL-23通過IL-12Rβ1和IL-23R異二聚體受體復(fù)合物來發(fā)送信號(hào)。O'Donnell等[11]研究發(fā)現(xiàn),IL-23可誘導(dǎo)Thl7細(xì)胞分化并分泌IL-17,在小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎(EAE)發(fā)病過程中起著重要作用。有研究稱IL-23可能與Th17細(xì)胞增殖有關(guān),并能為已分化的Th17細(xì)胞提供生存信號(hào)[8]。為探討IL-23對(duì)Th17細(xì)胞分化的影響,我們將IL-1β、IL-6、IL-23一同加入培養(yǎng)液中,發(fā)現(xiàn)此組Th17細(xì)胞分化頻率明顯高于其他各組(P＜0.01),表明初始T細(xì)胞分化過程中,IL-23可能直接誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化,或在維持Th17細(xì)胞增殖中起重要作用,這與國外報(bào)道一致[4]。

我們將PBC患者與正常人的Th17細(xì)胞分化差異進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),IL-1β、IL-6聯(lián)用或單獨(dú)IL-1β誘導(dǎo)時(shí),PBC患者與正常人Th17細(xì)胞分化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05),而在同時(shí)加入IL-1β、IL-6、IL-23誘導(dǎo)時(shí),兩者有顯著性差異(P＜0.01)。研究還發(fā)現(xiàn),與單獨(dú) IL-1β 或聯(lián)用 IL-1β、IL-6 相比,IL-1β 、IL-6、IL-23 共同誘導(dǎo)時(shí),無論是PBC患者還是正常人,其初始T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化效果均能達(dá)到最佳。且此時(shí)PBC患者Th17細(xì)胞分化效率明顯高于正常人(P＜0.01)。

目前,關(guān)于PBC患者體內(nèi)Th17細(xì)胞的過度增殖的確切機(jī)制尚不清楚。PBC作為一種自身免疫性肝病,是否其免疫異?？赡苁浅跏糡細(xì)胞分化傾向發(fā)生改變,或者可能是PBC患者初始T細(xì)胞與正常人相比在基因上存在差別,還有待進(jìn)一步的研究。我們期冀通過對(duì)PBC患者初始T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化誘導(dǎo)條件的研究,能為進(jìn)一步探索Th17細(xì)胞和揭示PBC發(fā)病機(jī)制等的研究產(chǎn)生積極的作用。

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