肺癌患者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的變化及CpG ODN的干預(yù)作用

何曉燁 蔡映云 (上海復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院老年病科,上海 200032)

肺癌是發(fā)病率較高的一種難治性惡性腫瘤,免疫系統(tǒng)的功能失衡會(huì)導(dǎo)致其發(fā)生、發(fā)展。同時(shí),肺癌免疫治療療效的不盡人意也提示著可能存在某些免疫逃逸因素。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是一類(lèi)具有免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群。既往的研究顯示,CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞參與了機(jī)體調(diào)節(jié)免疫耐受,并與腫瘤免疫逃逸過(guò)程有著密切的關(guān)系[1,2]。CpG ODN(cytosine-phosphorothioate-guanine oligodeoxyn ucleotides)是一類(lèi)含有胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤結(jié)構(gòu)的細(xì)菌DNA、質(zhì)粒DNA和寡核苷酸(ODN)的物質(zhì)。有文獻(xiàn)指出,CpG ODN能通過(guò)直接下調(diào)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞來(lái)有效增強(qiáng)自身抗腫瘤的免疫能力[3]。

本研究比較了初診、初治的肺癌患者與健康志愿者的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例、Foxp3基因表達(dá)、TGF-β和IFN-γ水平,并對(duì)肺癌患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行CpG ODN 2006(實(shí)驗(yàn)組)或CpG ODN 1612(安慰劑組)干預(yù),比較兩組在干預(yù)前后的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例、Foxp3基因表達(dá)、TGF-β及IFN-γ水平的變化。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集30例于2008年5月～9月間入住復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院胸外科的初診肺癌患者,均為未經(jīng)化療及其他生物治療的初治患者,不伴有自身免疫性疾病,均經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)為非小細(xì)胞肺癌。其中男性18例,女性 12例,平均年齡(60.07±13.1)歲(41～86歲)。組織學(xué)類(lèi)型:腺癌23例、鱗癌6例、混合性癌1例。根據(jù)2003年國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)的分期標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ期10例、Ⅱ期6例、Ⅲ期11例、Ⅳ期3例。對(duì)照組為30例健康志愿者。所有入選者均獲得知情同意。

1.2 主要儀器與試劑 OD260/280核酸定量分析儀(Pharmacia公司);PCR儀(PE公司);凝膠成像系統(tǒng)(Alpha Innotech公司);FACS Calibur流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson公司);淋巴細(xì)胞分離液(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);PCR引物、CpG ODN 2006及CpG ODN 1612委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成,Foxp3上游引物:5'-ACAGCACATTCCCAGAGTTCCT-3',下游引物:5'-TCTCCACCCGCACAAAGCA-3';CpG ODN 2006:5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3';CpG ODN 1612:5'-GCTAGAGCTTAGGCT-3';Trizol(Invitrogen公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司);50 bp DNA ladder(北京天根生物技術(shù)公司);2×Pfu PCRmaster mix(北京天根生物技術(shù)公司);FITC-CD4和PE-CD25抗體(Invitrogen公司);TGF-β及IFN-γ的ELISA試劑盒(上海元象醫(yī)療器械有限公司)。

1.3 標(biāo)本處理 采集肺癌患者和健康志愿者空腹?fàn)顟B(tài)下的外周靜脈血,分為2份。一份離心后取血清置-20℃冰箱保存,待測(cè)TGF-β及 IFN-γ。另一份用肝素抗凝,以淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),計(jì)數(shù)細(xì)胞后調(diào)整細(xì)胞濃度至1～2×106ml-1,以流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。

將肺癌患者的PBMC隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和安慰劑組,每組各15例。實(shí)驗(yàn)組給予1μ mol/L的CpG ODN 2006,安慰劑組給予 1 μ mol/L 的 CpG ODN 1612,在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)后收集細(xì)胞,以流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,并取上清液檢測(cè)TGF-β及IFN-γ。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 取100 μ l PBMC或經(jīng)培養(yǎng)后收集的細(xì)胞,加入 1 μ l FITC標(biāo)記的鼠抗人CD4,PE標(biāo)記的CD25抗體,避光孵育30分鐘后加入PBS洗滌2次,2 000 r/min離心5分鐘后棄上清,加入500 μ l PBS,FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5 RNA抽提及Real-time PCR 將患者和對(duì)照組的PBMC標(biāo)本用RNA抽提試劑盒提取總RNA,操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以此RNA為模板,加入引物oligo(dT)18及Rnase-free水,65℃加熱5分鐘,迅速在冰上冷卻。再加入逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTPs、逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA酶抑制劑,繼續(xù)反應(yīng)42℃50分鐘,99℃1分鐘。cDNA分別以GAPDH和Foxp3為引物,進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為:95℃5分鐘,94℃30秒,60℃30秒,72℃30秒,72℃10分鐘,共 40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,Foxp3擴(kuò)增片段192 bp,GAPDH擴(kuò)增片段450 bp,凝膠成像系統(tǒng)成像拍照,灰度掃描分析結(jié)果。將目的條帶的灰度值與內(nèi)參的灰度進(jìn)行比對(duì)得到目的基因的相對(duì)表達(dá)值。

1.6 TGF-β及IFN-γ檢測(cè) 取肺癌患者和健康志愿者血清以及肺癌患者PBMC在CpG ODN干預(yù)前后的上清液檢測(cè)TGF-β及IFN-γ,采用 ELISA法,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 肺癌患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例的變化情況 肺癌患者外周血中CD4+CD25+T占總CD4+T細(xì)胞比例明顯高于健康對(duì)照組(42.14%±14.32%vs 8.42%±2.69%,P＜0.05,圖 1)。在肺癌患者中不同病理類(lèi)型亞組的CD4+CD25+T占CD4+T細(xì)胞比例分別為腺癌43.96%±12.26%、鱗癌32.89%±19.3%、混合性癌55.8%,差異不具有顯著性(P＞0.05,表1);在不同分期亞組中分別為Ⅰ期46.88%±13.22%、Ⅱ期38.74%±22.11%、Ⅲ期37.77%±10.87%、Ⅳ期49.17%±6.73%,差異不具有顯著性(P＞0.05,表1)。

圖1 肺癌患者與健康志愿者外周血CD4+CD25+T細(xì)胞比例比較Fig.1 Proportion of CD4+CD25+T in PBMC of lung cancer patients and healthy volunteers

2.2 肺癌患者外周血Foxp3基因的表達(dá) RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,肺癌患者外周血的Foxp3基因的相對(duì)表達(dá)量要明顯高于健康對(duì)照組(0.96±0.44 vs 0.66±0.09,P ＜0.05,圖2)。

圖2 CpG ODN干預(yù)前后Foxp3基因的表達(dá)Fig.2 Foxp3 gene expression before and after CpG ODN treatment

2.3 肺癌患者血清TGF-β及IFN-γ檢測(cè)結(jié)果 肺癌患者血清TGF-β值明顯高于健康對(duì)照組,差異具有顯著性[(67.24±8.79)vs(33.58±4.74)pg/ml,P＜0.05,表1]。不同病理類(lèi)型患者亞組的TGF-β值分別為腺癌(68.10±9.51)pg/ml、鱗癌(64.95±5.83)pg/ml、混合性癌61.32 pg/ml,差異不具有顯著性(P＞0.05,表1)。不同分期患者亞組的TGF-β值分別為Ⅰ期(70.53±10.08)pg/ml、Ⅱ期(68.22±6.22)pg/ml、Ⅲ期(62.32±4.78)pg/ml、Ⅳ期(72.34±14.96)pg/ml,差異不具有顯著性(P＞0.05,表1)。肺癌患者血清IFN-γ值略低于健康對(duì)照組,但差異不具有顯著性[(30.40±9.52)vs(33.33±20.02)pg/ml,P＞0.05,表1)]。不同病理類(lèi)型患者亞組的IFN-γ值分別為腺癌(31.06±10.82)pg/ml、鱗癌(28.34±1.38)pg/ml、混合性癌55.8 pg/ml,差異不具有顯著性(P＞0.05,表1)。不同分期患者亞組的IFN-γ值分別為Ⅰ期(33.67±16.46)pg/ml、Ⅱ期(28.84±1.30)pg/ml、Ⅲ期(28.71±1.21)pg/ml、Ⅳ期(28.82±1.6)pg/ml,差異不具有顯著性(P＞0.05,表 1)。

2.4 CpG ODN干預(yù)后肺癌患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例、Foxp3基因表達(dá)、TGF-β及 IFN-γ變化 CpG ODN干預(yù)后,CpG ODN 2006干預(yù)組患者的CD4+CD25+T細(xì)胞比例降低[(44.16±11.61)vs(36.52±10.78)%,P＜0.05,表 2]、Foxp3基因表達(dá)減弱(1.15±0.48 vs 0.65±0.17,P ＜0.05,圖 2)、TGF-β水平降低[(68.25±9.25)vs(58.22±4.16)pg/ml,P＜0.05,表2)],IFN-γ水平的變化在干預(yù)前后無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(35.26±14.24 vs 28.99±1.03,P＞0.05,表2)。CpG ODN 1612安慰劑組患者的CD4+CD25+T細(xì)胞比例、Foxp3基因表達(dá)、TGF-β及 IFN-γ水平在干預(yù)前后的變化無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表1 肺癌患者 CD4+CD25+T細(xì)胞比例、TGF-β及IFN-γ檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Proportion of CD4+CD25+T,TGF-β and IFN-γin lung cancer patients

表2 肺癌患者外周血在 CpG ODN干預(yù)前后CD4+CD25+T細(xì)胞、Foxp3基因表達(dá)、TGF-β及IFN-γ變化情況Tab.2 The change of CD4+CD25+T,Foxp3 gene expression,TGF-β and IFN-γbefore and after CpG ODN treatment in PBMC of lung cancer patients

3 討論

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是具有特定表型和抑制功能的T淋巴細(xì)胞亞群,可通過(guò)多種方式抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)從啟動(dòng)到效應(yīng)的整個(gè)階段,在腫瘤免疫逃逸中起著重要作用。Foxp3是CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的一個(gè)特征性標(biāo)志,是其獲得免疫調(diào)節(jié)特性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。近年的研究發(fā)現(xiàn),腫瘤患者體內(nèi)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量增高是抑制腫瘤免疫的機(jī)制之一,它們通過(guò)與細(xì)胞直接接觸或分泌抑制性細(xì)胞因子,如TGF-β的方式發(fā)揮免疫抑制作用[4,5]。我們的研究發(fā)現(xiàn),肺癌患者外周血中的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例及TGF-β水平均明顯高于健康對(duì)照組,提示了肺癌患者的免疫系統(tǒng)處于抑制狀態(tài),但不同病理分型及不同分期的肺癌患者亞組間的比較無(wú)顯著差異。

含CpG序列(非甲基化胞嘧啶-鳥(niǎo)嘧啶二核苷酸為核心的特定核苷酸序列)的寡脫氧核苷酸(CpG ODN)不僅可通過(guò)啟動(dòng)機(jī)體病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecularpatterns,PAMPs)誘導(dǎo)分泌多種細(xì)胞因子,如IFN-γ等來(lái)激活機(jī)體免疫系統(tǒng),還可調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答向Th1型轉(zhuǎn)化、減少T細(xì)胞凋亡,從而起到抗腫瘤的作用[6,7]。如將序列中的CpG甲基化或?qū)pG替換成其他序列,如CpC、GpC等均將喪失或降低其免疫刺激作用。本研究中,我們分別以硫代化修飾、具有活性作用的CpG ODN 2006作為陽(yáng)性干預(yù)劑和不具有活性的CpG ODN 1612作為安慰劑干預(yù)肺癌患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CpG ODN 2006治療組的CD4+CD25+T細(xì)胞比例、Foxp3基因表達(dá)及TGF-β水平在干預(yù)后均較干預(yù)前有所下降,而安慰劑組的上述指標(biāo)則在干預(yù)前后無(wú)顯著差別。IFN-γ水平在干預(yù)前后的變化在兩組中均無(wú)顯著性差異。提示了CpG ODN具有下調(diào)CD4+CD25+Foxp3+的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例、減少TGF-β分泌的作用,但刺激IFN-γ的作用并不明顯。

1 Field EH,Matesic D,Rigby S et al.CD4+CD25+regulatory cells in acquired MHC tolerance[J].Immunol Rev,2001;182:99-112.

2 Somasundaram R,Jacob L,Swoboda R et al.Inhibition of cytolytic T lymphocyte proliferation by autologous CD4+/CD25+regulatory T cells in a colorectal carcinoma patient is mediated by transforming growth factor beta[J].Cancer Res,2002;62(18):5267-5272.

3 Smyth M J,Teng M W,Swann J et al.CD4+CD25+T regulatory cells suppressNK cell-mediated immunotherapy of cancer[J].J Immunol,2006;176(3):1582-1587.

4 Vollmer J.CpG motifs to modulate innate and adaptive immune responses[J].Int Rev Immunol,2006;25(3-4):125-134.

5 Wang R F.Regulatory T cells and toll-like receptors in cancer therapy[J].Cancer Res,2006;66(10):4987-4990.

6 Seo N,Hayakawa S,Takigawa M et al.Interleukin-10 express at early tumor sites induces subsequent generation of CD4+T regulatory cells and systemic collapse of antitumour immunity[J].Immunology,2001;103(4):449-457.

7 Chen Z M,O'Shaughnessy M J,Gramaglia I et al.IL-10 andTGF-beta induce alloreactive CD4+CD25-T cells to acquire regulatory cell function[J].Blood,2003;101(12):5076-5083.