王 新,許秋實,李 壯,王 博,周 昱

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科,黑龍江 佳木斯 154003;2.佳木斯大學(xué)2007級研究生,黑龍江 佳木斯 154007)

堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是目前認被為最具有活性的血管生長因子之一。而在乳腺組織中其惡性腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移很大程度上賴于滋養(yǎng)血管產(chǎn)生、生長。研究表明滋養(yǎng)腫瘤的血管生成是依賴于各種相關(guān)生長因子的誘導(dǎo)和調(diào)節(jié),其生長狀況可以視為是調(diào)節(jié)血管生成的正、負性因子相互作用相互制衡所產(chǎn)生的最終結(jié)果,而微血管密度(mi—crovesseldensity,MVD)值則是反映血管生成強度最關(guān)鍵指標(biāo)之一[1]。本研究即從此觀點出發(fā)使用 SP免疫組織化學(xué)方法檢測乳腺組織惡性腫瘤中 bFGF的表達、并通過對 MV D值進行相對定量觀察,探討 bFGF的高表達同兩種主要乳腺惡性腫瘤血管生成之間的相互關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選材2005— 06～ 2009— 06在佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院手術(shù)切除并經(jīng)病理證實的原發(fā)性乳腺癌組織石蠟包埋標(biāo)本285例。病人均系女性,年齡25～ 73歲,平均為 49歲。組織病理學(xué)分類浸潤性導(dǎo)管癌198例,浸潤小葉癌87例。病例均行改良根治手術(shù),術(shù)前病人均未行過放療,化療及其他抗腫瘤治療。所有標(biāo)本經(jīng)5%～ 10%甲醛溶液固定,石蠟包埋,制成4μ m厚連續(xù)切片、HE染色。

1.2 選用試劑

bFGF ELISA Kit Wako(堿性成纖維細胞生長因子bFGF-ELISA試劑盒)來自上海銳聰科技發(fā)展有限公司。CD34單克隆抗體來自眾磊(北京)生物科技發(fā)展有限公司?？乖迯?fù)緩為0.01mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)。

1.3 實驗方法

該實驗選取的組織經(jīng)石蠟包埋,制成厚約4微米的連續(xù)切片。采用 SP法免疫組織化學(xué)染色,二氨基聯(lián)苯胺顯色,在染色過程中以含0.05%吐溫-20的 pH7.4的磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對照,用已知的 bFGF表達為陽性的癌組織切片做陽性對照[2]。

1.3.1 bFGF結(jié)果判定[3]

已知 bFGF陽性物質(zhì)定位于細胞膜。觀察結(jié)果后選用Fromowitz陽性細胞半定量分級法(即采用染色強度記分與陽性細胞數(shù)量百分比記分相加之和的標(biāo)準(zhǔn) )(A)選取染色最明顯的部位根據(jù)染色深度不同分別進行計分,不著色部分記為0分;淡黃色、較之背景色稍高記為1分;棕黃色、較之背景色明顯增高記為2分;棕褐色或強烈著色者記為3分。(B)陽性細胞數(shù)量計分標(biāo)準(zhǔn)則是:＜5%記為0分,6%～ 25%記1分,26%～ 50%記為2分,51%～ 75%記為3分,＞ 75%記為 4分。最后將染色強度記分與陽性細胞數(shù)量百分比記分相加之和再分為 4級:強陽性 (+++)6～ 7分 ,中等陽性 (++ )4～ 5分 ,弱陽性 (+ )2～ 3分 ,陰性 (一 )0～ 1分。

1.3.2 MV D結(jié)果判定[4]

選取 Weidner的方法判斷是否陽性標(biāo)準(zhǔn)已知 CD34抗體存在于乳腺組織惡性腫瘤間質(zhì)血管中的內(nèi)皮細胞(EC)胞漿中,如果出現(xiàn)棕黃色顆粒則視為表達陽性,不出現(xiàn)棕黃色顆粒則視為表達陰性,根據(jù) Weidner所選用的方法即在一百倍的卡爾.蔡司的顯微鏡光學(xué)鏡頭下確定微血管分布密度最大的部分,在兩百倍的卡爾.蔡司的顯微鏡光學(xué)鏡頭視野下觀察累計5個不重復(fù)視野中含有 CD34著色血管數(shù)目,所得的平均數(shù)即可認為是 MV D值,選用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

使用 SPSS11.0軟件包統(tǒng)計實驗結(jié)果,分別應(yīng)用方差分析法,獨立樣本的 t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 浸潤性導(dǎo)管癌中 bFGF陰性與陽性的腫瘤微血管密度值比較

在浸潤性導(dǎo)管癌中腫瘤微血管密度值在腫瘤細胞 bFGF呈陰性組和其它三組 bFGF陽性組間存在明顯差異(P ＜0.05),陽性組 MVD值高于陰性組,且呈正相關(guān)且有統(tǒng)計學(xué)意義(相關(guān)系數(shù)0.64,P ＜0.05),見表1。

表1 在浸潤性導(dǎo)管癌中 bFGF陰性與陽性的腫瘤微血管密度值比較

2.2 浸潤性小葉癌中 bFGF陰性與陽性的腫瘤微血管密度值比較

在浸潤性小葉癌中腫瘤微血管密度值在腫瘤細胞 bFGF呈陰性組和其它三組 bFGF陽性組間存在明顯差異(P ＜0.05),陽性組 MVD值高于陰性組,且呈正相關(guān)且有統(tǒng)計學(xué)意義(相關(guān)系數(shù)0.57,P ＜0.05),見表2。

表2 在浸潤性小葉癌中 bFGF陰性與陽性的腫瘤微血管密度值比較

2.3 兩種惡性腫瘤 bFGF呈陽性組 MV D對比

在浸潤性導(dǎo)管癌中 bFGF呈陽性組和在浸潤性小葉癌中 bFGF呈陽性組 MVD綜合統(tǒng)計情況,由于兩個實驗組樣本量不同,且均屬于正態(tài)分布,使用獨立樣本的 t檢驗,t= 0.456,P＞ 0.05兩種乳腺組織惡性腫瘤 bFGF表達陽性組間 MV D表達無明顯差別。見表3。

表3 兩種惡性腫瘤 bFGF呈陽性組 MVD對比 ±s)

表3 兩種惡性腫瘤 bFGF呈陽性組 MVD對比 ±s)

3 討論

bFGF堿性成纖維細胞生長因子是含155個氨基酸的促有絲分裂的陽離子多肽家族中的一員,該家族成和員受體一般具有酪氨酸激酶的活性,其生物學(xué)效應(yīng)是通過特異性地結(jié)合細胞表面上的相應(yīng)受體發(fā)揮傳遞信息作用。其功效主要是在起源于神經(jīng)外胚層和中胚層的骨骼肌細胞、纖維母細胞和骨細胞等,該家族的受體相應(yīng)的也特異地分布于上述細胞表面。受體至少有4種形式,由細胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞漿區(qū)的近膜區(qū)和酪氨酸激酶區(qū)等結(jié)構(gòu)組成[5]。由于每種 FGF受體均能和 FGF家族每個成員結(jié)合,而不同 bFGF受體的表達存在著組織細胞特異性。bFGF與受體親和力顯著大于酸性 FGF(aFGF)。而這些途徑調(diào)節(jié)著內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和分化 ,最終能導(dǎo)致血管的形成[6]。通過本次實驗可得出結(jié)論,研究結(jié)果提示:bFGF參與并促進乳腺癌微血管的形成,并且其高表達可能與促進腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。本實驗發(fā)現(xiàn),在乳腺的惡性腫瘤中組織中腫瘤微血管密度值在腫瘤細胞bFGF呈陰性組和其它三組 bFGF陽性組間存在明顯差異(P ＜0.05),陽性組 MVD值高于陰性組,且呈正相關(guān)且有統(tǒng)計學(xué)意義(相關(guān)系數(shù)0＜r＜1,P＜0.05)而且呈正相關(guān)關(guān)系結(jié)論,通過研究進一步研究證實在乳腺組織不同的病理類型中堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)與腫瘤微血管密度值之間所表現(xiàn)的差異具有普遍性,即可證實 bFGF在乳腺組織惡性腫瘤中的普遍的高表達特性與腫瘤血管生成有相關(guān)性;因此足以認為 bFGF可能成為判斷乳腺組織生物學(xué)行為及預(yù)后的重要指標(biāo)之一。目前認為,腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多基因協(xié)同作用的結(jié)果。本研究結(jié)果表明:bFGF受體與乳腺癌組織血管生成有密切的關(guān)系性,然而成纖維細胞生長因子與腫瘤微血管密度值之間是如何相互聯(lián)系相互影響的以及在乳腺惡性腫瘤不同病理分型中的不同生理作用值得進一步探討,如能在臨床病理工作中開展 bFGF受體檢測將會對指導(dǎo)臨床治療、預(yù)測患者的預(yù)后有著相當(dāng)深遠的意義[7]。

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