陜西省中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科(西安 710003)張硯敏 胡 凱 張 蕾

膽固醇是確診高脂血癥的重要指標(biāo)之一。經(jīng)對(duì)國(guó)內(nèi)外大量文獻(xiàn)書(shū)籍查閱,紅細(xì)胞膽固醇(Erythrocytc cholesterol,E-ch)含量較之血清膽固醇含量更能客觀、靈敏的反應(yīng)一些疾病的存在,如冠心病[1]、動(dòng)脈粥樣硬化[2],原發(fā)性高血壓[3],糖尿病[4],甲狀腺功能亢進(jìn)[5]等。而目前用樣量少,精密度,準(zhǔn)確度好的紅細(xì)胞膽固醇含量檢測(cè)方法僅適于科研。建立具有較高精密度、準(zhǔn)確度和較大檢測(cè)能力,微量快速,簡(jiǎn)便易行,臨床適用的紅細(xì)胞膽固醇測(cè)定法,日益受到國(guó)內(nèi)外的重視,且勢(shì)在必行。我院經(jīng)查閱國(guó)內(nèi)外有關(guān)資料,初步建立了紅細(xì)胞膽固醇熒光測(cè)定法,現(xiàn)分析報(bào)告如下。

對(duì)象與方法

1 研究對(duì)象 高脂血癥組:40例,其中男 20例 ,女 20例,平均年齡 50± 2歲;血漿 TC均≥ 6.47 mmol/L;冠心病組:18例,其中男 15例,女 5例,平均年齡 65±6歲,臨床均明確診斷為冠心病患者;健康對(duì)照組:40例 ,其中男 20例 ,女 20例 ,平均年齡 50±2歲,均系本院體檢正常職工。

2 試劑與儀器 膽固醇酶試劑盒(東甌),1mmol/LL-酪氨酸 (AR),pH10.5、0.1mol/L N H3-N H4Cl緩沖液,SFM-25熒光儀(Kontron,Gemany),7060型生化分析儀(HITACHI),SF3000血球分析儀(SYSTEM)。

3 測(cè)定原理 利用雙蒸水破壞紅細(xì)胞膜,溶血,充分暴露紅細(xì)胞膜內(nèi)外層的膽固醇酯、游離固醇,二者在膽固醇酯酶(CEH)、膽固醇氧化酶(CHOD)的作用下,生成 4-膽甾烯酮和H2O2,H2O2在過(guò)氧化物酶的催化下氧化底物酪氨酸,產(chǎn)生具有熒光的酪氨酸二聚體,此熒光的激發(fā)波長(zhǎng) 317nm、發(fā)射波長(zhǎng)411nm[5],用熒光儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度,熒光強(qiáng)度與膽固醇的濃度呈正比,與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較求出全血膽固醇濃度。經(jīng)過(guò)(全血 Tc-血漿 Tc)/紅細(xì)胞壓積+血漿 Tc,計(jì)算出紅細(xì)胞膽固醇濃度。

4 檢測(cè)方法[6]

4.1 血漿膽固醇測(cè)定:取靜脈血 3ml肝素抗凝,用于在生化分析儀上檢測(cè)血漿膽固醇含量、在血球分析儀上檢測(cè)血球壓積。

4.2 紅細(xì)胞膽固醇測(cè)定 :取抗凝血 0.05ml,加 1ml雙蒸水制備溶血液[6]。取溶血液 10μl,加入 1ml酶試劑,再加 1ml酪氨酸試劑,置 37℃15min,加 4mlNH3-NH4+緩沖液為測(cè)定管,空白管將酶試劑改為雙蒸餾水,其余操作與測(cè)定管相同,系列膽固醇濃度標(biāo)準(zhǔn)管 (2.1、 4.5、6.6、8.9、 11.2)mmol/L,操作與測(cè)定管相同,用熒光儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度,與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較求出全血膽固醇濃度。

4.3 計(jì)算方法:紅細(xì)胞 Tc(mmol/L)=(全血 Tc-血漿Tc)/紅細(xì)胞壓積+血漿 Tc。

結(jié) 果

1 紅細(xì)胞膽固醇與血漿膽固醇測(cè)定結(jié)果對(duì)比 見(jiàn)附表。紅細(xì)胞膽固醇男性高于女性,且在冠心病組中明顯升高;而血漿膽固醇在高脂血癥組中升高。

附表 紅細(xì)胞 Tc血漿 Tc測(cè)定結(jié)果對(duì)比(mmol/L,±s)

附表 紅細(xì)胞 Tc血漿 Tc測(cè)定結(jié)果對(duì)比(mmol/L,±s)

組 別 n 紅細(xì)胞 血 漿正常男性 20 4.63± 0.56 4.84± 0.79正常女性 20 3.82± 0.55 4.82± 0.89冠 心 病 18 5.55±0.57 4.64±0.71高脂血癥 40 4.55± 0.47 7.64± 0.91

2 精密度 批內(nèi):4.11±0.115mmol/L,CV=2.7%(n=20);批間:4.21± 0.135 mmol/L,CV=3.2%(n=20)。

3 線 形范圍 定值血清稀 釋為 (2.1、3.2、 4.5、 5.5、 6.6、7.8、 8.8、 9.8、 10.8、 11.8、12.8、 13.8、 14.8)mmol/L,測(cè)定上界為13mmol/L。

4 回收率 本組回收率為 96.1%～99.3%,平均 97.5%。

討 論

紅細(xì)胞膽固醇水平的測(cè)定,已被臨床逐步采用,但由于用樣量少,精密度,準(zhǔn)確度高的紅細(xì)胞膽固醇含量檢測(cè)方法繁瑣,操作時(shí)間過(guò)長(zhǎng),所需儀器設(shè)備價(jià)昂,僅適于科研,難以在一般實(shí)驗(yàn)室中開(kāi)展和在臨床廣泛應(yīng)用。因而許多學(xué)者致力于研究建立一種微量快速、簡(jiǎn)便易行、準(zhǔn)確、精密的檢測(cè)方法。

本組應(yīng)用紅細(xì)胞膽固醇熒光測(cè)定法對(duì) 40例高脂血癥、18例冠心病患者及 40例健康對(duì)照者進(jìn)行測(cè)定,其結(jié)果顯示:冠心病組與正常對(duì)照組比較,血漿膽固醇并無(wú)多大差異,但紅細(xì)胞膽固醇含量明顯高于對(duì)照組,表明紅細(xì)胞膽固醇是比血漿膽固醇更靈敏的冠心病的檢測(cè)指標(biāo)。在高脂血癥患者中,雖然血漿膽固醇明顯高于正常對(duì)照組,但紅細(xì)胞膽固醇卻無(wú)異常,這與國(guó)內(nèi)有關(guān)報(bào)道一致,國(guó)內(nèi)有關(guān)報(bào)道認(rèn)為血漿膽固醇與紅細(xì)胞膽固醇含量變化是一致的,其原因有待于進(jìn)一步研究,紅細(xì)胞內(nèi)膽固醇男性高于女性,可能與性激素分泌有關(guān),確切機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

紅細(xì)胞膽固醇測(cè)定一是利用膽固醇與酶試劑作用產(chǎn)生的H2O2氧化底物酪氨酸,產(chǎn)生具有熒光的酪氨酸二聚體,通過(guò)檢測(cè)酪氨酸二聚體的熒光強(qiáng)度可對(duì)全血膽固醇定量測(cè)定。熒光法較之以往的吸光度法有更高的靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度。二是無(wú)需用有機(jī)溶劑抽提膽固醇,避免有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)造成的膽固醇丟失,避免有機(jī)溶劑對(duì)酶活性的干擾,避免試驗(yàn)中水相有機(jī)相兩相互相轉(zhuǎn)換造成的誤差、計(jì)算復(fù)雜等。三是不洗滌紅細(xì)胞,避免了繁瑣操作,減少了干擾因素。四是此方法簡(jiǎn)便易行,微量快速,試劑無(wú)毒,無(wú)腐蝕,無(wú)需特殊防護(hù)措施。

[1]許延康,吳秋玲,龍江斌,等.紅細(xì)胞膽固醇含量在冠心病診斷上的意義[J].中華心血管病雜志,1983,11(2):92-95.

[2]周君富,黃鑒政.人紅細(xì)胞膽固醇含量的增齡變化 [J].中國(guó)老年醫(yī)學(xué)雜志,1995,15(1):27-30.

[3]符云峰,董玉枝,李 紅,等.原發(fā)性高血壓患者紅細(xì)胞膜脂質(zhì)組成及流動(dòng)性變化的研究[J].天津醫(yī)藥,1991,8:486-487.

[4]栗夏蓮,歐陽(yáng)安,周慕英,等.甲亢病人血清及紅細(xì)胞膜膽固醇含量的變化 [J].中華內(nèi)分泌代謝雜志,1990,6(3):175-176.

[5]王全林,劉志洪,蔡汝秀,等.血紅蛋白催化熒光法測(cè)定其氫供體底物酪氨酸[J].分析實(shí)驗(yàn)室,2004,24(2):46-49.

[6]鄭才岳.紅細(xì)胞內(nèi)膽固醇簡(jiǎn)易測(cè)定法及其臨床意義 [J].陜西醫(yī)學(xué)檢驗(yàn),1994,9(2):74-75.