趙榮國，真國輝，王賀雙

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10-羥基喜樹堿的提取方法及工藝優(yōu)化研究

趙榮國，真國輝，王賀雙

116023 大連國人生物科技有限公司（趙榮國、真國輝）；116024 大連理工大學(xué)環(huán)境與生命學(xué)院（王賀雙）

10-羥基喜樹堿是從我國特有植物喜樹（）中分離得到的 20 多個單體中抗腫瘤作用最強的生物堿，它不僅是臨床效果較好的抗腫瘤藥物，而且還是制備其他喜樹堿類衍生物藥品的重要中間體。由于喜樹中 10-羥基喜樹堿含量甚微，其制備方法的研究已成為當(dāng)前熱點，其中利用現(xiàn)代生物工程技術(shù)的方法尤為引人注目[1]。但至今鮮有報道從喜樹細胞培養(yǎng)物中提取天然 10-羥基喜樹堿的生產(chǎn)工藝[2-5]，本文就經(jīng)次生代謝調(diào)控和微生物轉(zhuǎn)化后的喜樹細胞培養(yǎng)物中提取天然 10-羥基喜樹堿的方法及工藝進行了研究，以期為規(guī)?；a(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 試劑 甲醇、乙醇，分析純，購自天津東麗化學(xué)試劑廠；二氯甲烷，分析純，購自天津瑞金化學(xué)試劑廠；氫氧化鈉、石油醚、環(huán)己烷，分析純，購自北京化工廠；10-羥基喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)品由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.1.2 儀器 高效液相色譜儀為美國 Waters 公司產(chǎn)品；Techsphere ODS 色譜柱和 KQ2250DB 超聲波清洗儀均為大連依利特分析儀器有限公司產(chǎn)品；RS-20III冰凍高速離心機為日本Tokyo 公司產(chǎn)品；H.H.S21.6 恒溫水浴鍋為上海醫(yī)療器械五廠產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)物樣品 將收獲的細胞培養(yǎng)物于 60℃烘箱中烘干后粉碎，過 60 目篩備用。

1.2.2 乙醇回流提取 稱取細胞培養(yǎng)物樣品 10 g，按表 1 設(shè)計因素水平，選 L9（34）正交設(shè)計表，進行乙醇回流提取，收集提取液，濃縮后進行測定。

表 1 試驗因素水平表

1.2.3 堿水回流提取 稱取細胞培養(yǎng)物樣品 10 g，按表 2 設(shè)計因素水平，選 L9（34）正交設(shè)計表，加稀 NaOH 溶液回流提取，收集提取液，適當(dāng)濃縮，調(diào) pH 至 6.0 左右，離心半徑 9 cm，8 000 r/min 離心10 min，沉淀用適量甲醇溶解后進行測定。

1.2.4 乙醇超聲提取 稱取細胞培養(yǎng)物樣品 10 g，在 25 ℃，工作頻率為 40 kW 的條件下，分別以 15、20 倍量的 75%乙醇超聲提取 30 和 60 min，見表 3。

表 2 試驗因素水平表

表 3 超聲提取試驗表

1.3 含量測定

1.3.1 高效液相色譜條件 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水（60:40）為流動相；流速 1.0 ml/min；柱溫 25 ℃；檢測波長為 266 nm；出峰時間約 24 min。

1.3.2 樣品測定 按照 10-羥基喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)品的測定條件，分別測定乙醇回流提取樣品、堿水回流提取樣品以及超聲提取樣品中 10-羥基喜樹堿的含量。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取0.02 mg/ml 的 10-羥基喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)液，稀釋成 0.8 × 10-3~ 12 × 10-3mg/ml 的系列溶液，進樣 20 μl，以濃度與峰面積進行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y = 68.552X+32.138，= 0.9995。10-羥基喜樹堿在 0.8 × 10-3~ 12 × 10-3mg/ml 時濃度與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

2.2 乙醇回流提取工藝的正交試驗

根據(jù)極差 R 的大小，其影響順序為 A > D > B > C，即乙醇濃度 > 提取次數(shù) > 提取時間 > 溶劑量，最佳工藝為 A1B3C3D3，即 20 倍 75% 乙醇回流提取 3 次，1.5 h/次，結(jié)果見表 4。

2.3 堿水回流提取工藝的正交試驗

根據(jù)極差 R 的大小，其影響順序為 A > D > B > C，即堿的濃度 > 提取次數(shù) > 提取時間 > 溶劑量，最佳工藝為 A2B1C2D3，即 15 倍 0.3% NaOH 溶液回流提取 3 次，0.5 h/次，結(jié)果見表 5。

表 4 乙醇回流提取正交試驗安排及結(jié)果

表 5 堿水回流提取正交試驗安排及結(jié)果

2.4 乙醇超聲提取

由表 6 可以看出，與乙醇回流提取最佳工藝相比，乙醇超聲提取 10-羥基喜樹堿的得率更高。

3 討論

通過考察不同的提取方法對 10-羥基喜樹堿提取的影響，結(jié)果表明：乙醇回流提取時以75% 乙醇作溶劑效果較好，可能是高濃度乙醇不易穿透脫分化組織的細胞壁；堿水回流提取的效果較差，可能是 10-羥基喜樹堿 E 環(huán)的 α-羥基內(nèi)酯結(jié)構(gòu)遇堿開環(huán)生成鈉鹽后，再遇酸不能完全還原為 10-羥基喜樹堿的緣故；以 75% 乙醇作溶劑進行超聲提取，有利于喜樹細胞培養(yǎng)物中 10-羥基喜樹堿的提取，收率高且工藝簡單。由于超聲波可以使液體流動，并產(chǎn)生空化現(xiàn)象，從而有利于將 10-羥基喜樹堿從喜樹脫分化組織中快速地浸提出來。喜樹細胞培養(yǎng)物中 10-羥基喜樹堿提取的最佳工藝為 20 倍量的 75% 乙醇超聲提取 60 min。

表 6 乙醇超聲提取結(jié)果

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大連市產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新資金項目（2008039）

2009-09-25

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.02.014

趙榮國，Email：zrgmail@sina.com