“四天穴”針?lè)綄?duì)動(dòng)靜力失衡性頸椎病模型大鼠炎性因子mRNA表達(dá)的影響*

周 震，王遵來(lái)，王秀云，孟向文，尚秀葵

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院針灸部，天津 300150；2.天津市北辰北門醫(yī)院，天津 300400；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

頸椎病是由于頸椎間盤退變而引起的一種血管、脊髓和神經(jīng)功能障礙性疾病，其發(fā)生機(jī)制與頸椎間盤外周炎癥病理網(wǎng)絡(luò)鏈中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，即炎性因子的表達(dá)具有密切關(guān)系。本研究在前期對(duì)“四天穴”針?lè)脚R床試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)動(dòng)靜力失衡性頸椎病模型大鼠頸椎間盤中炎性因子基因含量的檢測(cè)，初步探索該針?lè)窖泳忣i椎病椎間盤退變的作用，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康6月齡Wistar雄性大鼠60只，體質(zhì)量（200±20）g。由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供（動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2002-0003）。

1.2 主要試劑 Tripure試劑（Boehringer Mannhein公司產(chǎn)品）；SuperScript RTs試劑盒（Gibco公司產(chǎn)品）；焦碳酸二乙酯（Diethylpyrocarbonate，DEPC，Sigma公司產(chǎn)品）；脫氧核苷三磷酸（dNTP，Phermacia公司產(chǎn)品）；TaqDNA聚合酶及緩沖系統(tǒng)。目的基因及內(nèi)參基因β-actin引物序列均購(gòu)自上海生工生物科技公司，序列如下：目的基因IL-1β（擴(kuò)增長(zhǎng)度245 bp）5’-CTC CATGAG CTT TGT ACAAGG-3’，5’-TGCTGA TGT ACC AGT TGG GG-3’；iNOS（擴(kuò)增長(zhǎng)度 317 bp）5’-CCA AGA ACG TGT TCA CCATG-3’，5’-GAT GTC CAG GAA GTA GGT GAG G-3’；內(nèi)參基因 β-actin（擴(kuò)增長(zhǎng)度 764 bp）5’-TTG TAA CCA ACT GGG ACG ATA TGG-3’，5’-GAT CTT GAT CTT CAT GGT GCT AG-3’。

1.3 動(dòng)物分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為4組，即假手術(shù)組、模型組、四天穴針刺組、夾脊穴針刺組，每組各15只。每組再分為治療1、2、4周，共計(jì)3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各5只。

1.4 動(dòng)靜力失衡性頸椎病模型大鼠的制備 采用上海中醫(yī)藥大學(xué)脊柱病研究所造模方法[1]，重復(fù)建立動(dòng)靜力失衡性頸椎病模型。

1.5 治療方法 大鼠腧穴定位根據(jù)中國(guó)針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸研究會(huì)制定的《動(dòng)物針灸穴位圖譜》并結(jié)合比較解剖學(xué)進(jìn)行。針刺選穴：四天穴針刺組選取雙側(cè)天鼎、天窗、天容、天牖穴。夾脊穴針刺組選取C3～C6頸夾脊穴。針刺操作時(shí)，四天穴針刺組將大鼠置于麻醉罐中95%乙醚淺麻醉后固定，大鼠頸后部剪毛、消毒，所有穴位均為直刺，深度至頸椎椎體表面，施捻轉(zhuǎn)提插手法強(qiáng)刺激30 s后出針，1次/d。夾脊穴針刺組麻醉、固定、剪毛、消毒同四天穴組，所有穴位均為45度角斜刺，沿C3～C6夾脊肌外側(cè)至頸椎椎體表面，施捻轉(zhuǎn)提插手法強(qiáng)刺激30 s后出針，1次/d。

1.6 取材及保存 大鼠急性失血法處死后，于4倍手術(shù)顯微鏡下沿上、下軟骨終板與椎體的交界面完整取下C3～C4、C5～C6椎間盤，其中C3～C4椎間盤投入4%多聚甲醛水溶液固定液瓶中，C5～C6椎間盤放入Eppendorf管，迅速投入液氮中保存。

1.7 實(shí)驗(yàn)方法及觀察指標(biāo)

1.7.1 形態(tài)學(xué)觀察 C3～C4椎間盤采用固定、切片、HE染色后，在100 X線學(xué)顯微鏡下對(duì)大鼠椎間盤組織形態(tài)觀察，每個(gè)標(biāo)本取連續(xù)5張切片，按Miyanmoto等[2]的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)將頸椎間盤分為1～5級(jí)，具體分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 Miyanmoto椎間盤分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Miyanmoto classification standard of cervical disc

1.7.2 分子生物學(xué)檢測(cè) C5～C6椎間盤采用分子生物學(xué)逆轉(zhuǎn)錄-聯(lián)合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）法檢測(cè)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR操作流程：Trizol法提取頸椎間盤組織中總RNA；RNA變性電泳；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA）；多聚酶鏈反應(yīng)（反應(yīng)條件：94℃預(yù)熱 2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min）；凝膠電泳；用密度掃描儀對(duì)特異性條帶進(jìn)行密度掃描。檢測(cè)頸椎間盤中白介素-1β（IL-1β）及 iNOSmRNA 表達(dá)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差（one-way ANOWA）分析。

2 結(jié)果

2.1 各實(shí)驗(yàn)組頸椎間盤退變程度（IDDG）比較 見(jiàn)表2。

表2 各實(shí)驗(yàn)組頸椎間盤退變程度（IDDG）比較(±s)Tab.2 Comparison of the degree of intervertebral disc degeneration in the intervertebral disc in each groups(±s)

表2 各實(shí)驗(yàn)組頸椎間盤退變程度（IDDG）比較(±s)Tab.2 Comparison of the degree of intervertebral disc degeneration in the intervertebral disc in each groups(±s)

注：經(jīng)單因素方差分析，與假手術(shù)組同項(xiàng)目比較，★P<0.05，★★P<0.01；與模型組同項(xiàng)目比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；夾脊穴針刺組間，與1周比較，犖P<0.05；四天穴針刺組間，與 1 周比較，△P<0.05，△△P<0.01。

組別假手術(shù)組模型組夾脊穴針刺組四天穴針刺組n5555治療1周1.20±0.454.00±0.71★★3.20±0.45★★▲3.60±0.55★★▲治療2周1.40±0.554.20±0.45★2.80±0.84★▲▲2.60±0.89★▲▲△治療4周1.20±0.454.20±0.84★2.20±0.45★▲▲犖2.20±0.45★▲▲△△

2.2 各實(shí)驗(yàn)組頸椎間盤IL-1βmRNA表達(dá)結(jié)果 見(jiàn)表3。

表3 各實(shí)驗(yàn)組頸椎間盤IL-1βmRNA表達(dá)結(jié)果比較(±s)Tab.3 comparison of the expression IL-1β mRNA in the Intervertebral disc in each groups(±s)

表3 各實(shí)驗(yàn)組頸椎間盤IL-1βmRNA表達(dá)結(jié)果比較(±s)Tab.3 comparison of the expression IL-1β mRNA in the Intervertebral disc in each groups(±s)

注：經(jīng)單因素方差分析，與模型組同項(xiàng)目比較，★★P<0.01；與四天穴位針刺組同項(xiàng)目比較，△P<0.05；夾脊穴針刺組間，與1周比較，☆P<0.05；與 2 周比較，▲P<0.01；四天穴針刺組間，與 1周比較，犖P<0.05；與 2 周比較，▲P<0.05。

組別假手術(shù)組模型組夾脊穴針刺組四天穴針刺組n5555治療1周1.202±0.0271.222±0.1330.816±0.067★★△0.750±0.140★★治療2周0.177±0.0381.084±0.6170.685±0.144★★△☆0.502±0.192★★犖治療4周1.20±0.454.20±0.84★2.20±0.45★▲▲犖2.20±0.45★▲▲△△

2.3 各實(shí)驗(yàn)組頸椎間盤iNos mRNA表達(dá)結(jié)果 見(jiàn)表4。

表4 各實(shí)驗(yàn)組頸椎間盤iNos mRNA表達(dá)結(jié)果(±s)Tab.4 Comparison of the expression iNOS mRNA in the intervertebral disc in each groups(±s)

注：經(jīng)單因素方差分析，與模型組比較，★★P<0.01；夾脊穴針刺組間，與1周比較，☆P<0.01；與2周比較，茛P<0.05；四天穴針刺組間，與1 周比較，犖P<0.05；與 2 周比較，▲P<0.05。

組別假手術(shù)組模型組夾脊穴針刺組四天穴針刺組n5555治療1周0.100±0.0291.136±0.1090.780±0.099★★0.633±0.110★★治療2周0.073±0.0251.014±0.1750.474±0.116★★☆0.504±0.119★★犖治療4周0.051±0.0220.911±0.1650.339±0.077★★☆茛0.347±0.114★★犖▲

3 討論

越來(lái)越多的證據(jù)表明，在椎間盤退變—炎癥反應(yīng)—根性痛網(wǎng)絡(luò)鏈中，炎癥損傷起了更為主要的作用。一些生化介質(zhì)參與了這種改變，其中尤以IL-1的作用引人注目。IL-1β是一種重要的前炎性細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)細(xì)胞間黏附分子的表達(dá)，并介導(dǎo)了中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的聚集和浸潤(rùn)。其作為椎間盤退變過(guò)程的潛在始動(dòng)因素，對(duì)其退變過(guò)程的影響是多環(huán)節(jié)的，既可通過(guò)誘導(dǎo)金屬蛋白酶（MMPs）和一氧化氮（NO）促進(jìn)髓核中蛋白聚糖（PG）的分解及抑制PG合成，導(dǎo)致PG的凈丟失而影響退變本身，也可通過(guò)其他炎性介質(zhì)影響其繼發(fā)性病理過(guò)程[3]。

此外，突出的椎間盤還可自發(fā)分泌NO，IL-1可刺激其進(jìn)一步分泌。NO除抑制PG合成外，還是一種新的炎癥介質(zhì)和神經(jīng)遞質(zhì)，不但具有極強(qiáng)的擴(kuò)張血管和增加血管通透性的作用。而且在炎癥反應(yīng)中也起重要作用，同時(shí)能增強(qiáng)傷害性感受器的敏感性，參與椎間盤退變所導(dǎo)致的神經(jīng)根痛病理過(guò)程。

“四天穴”針?lè)綖閷?dǎo)師劉公望教授長(zhǎng)期臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，主要包括天鼎、天窗、天容、天牖四穴，均位于頸項(xiàng)部，分別屬手陽(yáng)明、手太陽(yáng)、手少陽(yáng)經(jīng)穴。正如“經(jīng)脈所過(guò)，主治所及”，四穴合用可激發(fā)經(jīng)絡(luò)之氣，使氣至病所，疏經(jīng)活血通絡(luò)而達(dá)治療目的。該針?lè)浇?jīng)10余年長(zhǎng)期大量臨床觀察，證明其療效確切，可有效改善患者的臨床癥狀，且預(yù)后良好[4-7]。

本研究通過(guò)Miyanmoto椎間盤分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)“四天穴”針?lè)綄?duì)頸椎間盤組織形態(tài)學(xué)的影響，結(jié)果顯示，模型組、“四天穴”針刺組及夾脊穴針刺組3組均有不同程度退變的表現(xiàn)，模型組退變程度最重，其余針刺兩組退變程度較輕，其中“四天穴”針刺組退變程度最輕。初步判定，“四天穴”針?lè)侥苡行Ц纳祁i椎間盤退變的形態(tài)學(xué)改變。

同時(shí)，采用分子生物學(xué)RT-PCR法觀察該針?lè)▽?duì)椎間盤中IL-1βmRNA及iNOSmRNA表達(dá)的影響。吸光度掃描（IOD）分析，與模型組比較，四天穴針刺組及夾脊穴針刺組對(duì)頸椎間盤中炎癥因子IL-1β及iNOS基因表達(dá)都有一定程度的抑制作用，且在4周時(shí)IOD數(shù)值均值最小，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異（P<0.05）；兩針刺組間比較有顯著性差異（P<0.05）；表明四天穴針刺組要明顯優(yōu)于夾脊穴針刺組；四天穴針刺組間比較，在1、2及4周3個(gè)時(shí)間相中，2周組、4周組均顯著低于1周組，4周組也顯著低于2周組。結(jié)果表明，針刺“四天穴”針?lè)侥芙档湍Ｐ痛笫箢i椎間盤內(nèi)炎性因子IL-1βmRNA、iNOSmRNA的表達(dá)，具有抑制外周炎性因子的作用。且隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，“四天穴”針?lè)ǖ闹委熜Ч絹?lái)越明顯，這也與在前期臨床觀察中及上述實(shí)驗(yàn)中得到的結(jié)果是一致的。

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