李慎賢，吳洪雷

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院中醫(yī)科，沈陽(yáng) 110004）

下肢動(dòng)脈粥樣硬化閉塞癥（ASO）是一種常見(jiàn)的周圍血管疾病。研究表明，長(zhǎng)期的高脂飲食及物理化學(xué)因素等刺激，加速了全身動(dòng)脈硬化的形成，而ASO的形成和發(fā)展是長(zhǎng)期動(dòng)脈硬化的結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高脂飲食喂養(yǎng)家兔及股動(dòng)脈血管內(nèi)膜造成機(jī)械性損傷模擬ASO，以化濁通脈散干預(yù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)前后家兔的生化指標(biāo)及電鏡觀察局部血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)，以探討化濁通脈散對(duì)其影響及作用，結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭大耳白兔40只，4月齡，體質(zhì)量2.5～2.8 kg，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK（遼）2003－0013。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 化濁通脈散組成:黃芪50 g，赤芍20 g，川芎 20 g，當(dāng)歸 20 g，地龍 20 g，紅花 10 g，川牛膝10 g，水蛭 10 g，澤瀉10 g，焦山楂20 g，由三九藥業(yè)集團(tuán)提供，批號(hào)：0807021；阿司匹林：由沈陽(yáng)奧華制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：080606；膽固醇：由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑沈陽(yáng)有限公司提供，批號(hào)：F20071220；牛血清白蛋白注射液：由北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)：20080815。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 主要試劑：血栓烷素（TXB2）、6-酮-前列腺素 F1α（6-Keto-PGF1α）、內(nèi)皮素（ET）試劑盒均由北京北方生物技術(shù)研究所提供，批號(hào)：20090210；一氧化氮（NO）試劑盒由南京建成生物研究所提供，批號(hào)：20081030。主要儀器：中健GC1500-r放射免疫計(jì)數(shù)器由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一臨床醫(yī)院放免科提供。JEM-1200ER透射電子顯微鏡（TEM），由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)電鏡室提供；酶標(biāo)儀2010，奧地利安托斯儀器公司，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四臨床醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模與分組 實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，排除飲食異常者。1周后隨機(jī)分為4組，每組10只：即化濁通脈散組（A），阿司匹林組（B），模型組（C），假手術(shù)組（D），分籠飼養(yǎng)。D組喂養(yǎng)普通飼料，自由飲水。其余3組自實(shí)驗(yàn)開(kāi)始喂高脂飲食（正常飼料中加膽固醇1 g，豬油5 g），共喂養(yǎng)12周。其中實(shí)驗(yàn)開(kāi)始第3天對(duì)全部家兔以10%水合氯醛5 mL/kg腹腔麻醉，行左側(cè)股動(dòng)脈插管，在大腿近端沿左股動(dòng)脈走行處，鈍性分離出股動(dòng)脈約2 cm，動(dòng)脈壁上剪一小口后插入球囊至大腿近端處，球囊反復(fù)牽拉8次，以確保內(nèi)膜損傷，退出導(dǎo)管，慶大霉素稀釋液沖洗傷口。逐層縫合皮下組織和皮膚。術(shù)后肌肉注射慶大霉素8萬(wàn)U一次預(yù)防感染。手術(shù)后第4天A、B、C組靜脈注射牛血清白蛋白250 mg/kg；D組注射等量的生理鹽水。第13周開(kāi)始A、B、C 3組均改為普通飼料喂養(yǎng)，A組予化濁通脈散7.2 g/（kg·d）混入飼料（藥物均根據(jù)“人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率表”計(jì)算[1]）；B組給予腸溶阿司匹林12.6 mg/（kg·d）混入飼料中；D組繼續(xù)給予普通飼料喂養(yǎng)，C、D兩組均未加任何藥物；在以上條件下共喂養(yǎng)3周。

1.2.2 各實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定及方法 造模前與實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)分別取兔耳緣靜脈取外周靜脈血2 mL，均以2500 r/min離心30 min，取得血清。應(yīng)用放射免疫γ計(jì)數(shù)器，采用放免法分別檢測(cè)TXB2、6-Keto-PGF1α、ET；應(yīng)用酶標(biāo)儀以硝酸還原酶法測(cè)NO，比較各組數(shù)值造模前后及組間的變化。

1.2.3 取材及局部血管高倍透射電子顯微鏡（TEM）觀察 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取血清的同時(shí)，應(yīng)用麻醉法處死全部動(dòng)物，切取左髂股動(dòng)脈2～3 cm，縱行切開(kāi)，切取0.5 cm經(jīng)5%戊二醛溶液固定，1%鋨酸固定后，梯度乙醇脫水，樹(shù)脂包埋，備TEM觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用方差分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，用 SNK-q Test進(jìn)行組間比較，P<0.05 表示有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 生化檢驗(yàn)結(jié)果 造模前 NO、ET、6-Keto-PGF1α、TXB2各組比較無(wú)明顯差異（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，A組與B組、C組相比較：NO及6－Keto－PGF1α 明顯高于 B、C 兩組（P＜0.01），且 A 組高于B 組（P＜0.01），說(shuō)明化濁通脈散具有升高 NO 及 6－Keto－PGF1α的作用，且作用優(yōu)于阿司匹林，而ET及 TXB2明顯低于 B、C 組（P＜0.01），說(shuō)明化濁通脈散具有降低ET及TXB2的作用；A組與D組相比，A組 6－Keto－PGF1α 低于 D 組，（P＜0.01），TXB2高于D 組（P＜0.01），具體數(shù)據(jù)詳見(jiàn)表 1。

表1 各組動(dòng)物血生化比較(±s)Tab.1 Comparison of blood biochemical indexes in various groups(±s，n=10)ng/L

表1 各組動(dòng)物血生化比較(±s)Tab.1 Comparison of blood biochemical indexes in various groups(±s，n=10)ng/L

注：A組與B組、C組，有顯著性差異，*P＜0.01；A組與B組、C 組，有顯著性差異，△P＜0.01；A 組與 D組，有顯著性差異，#P＜0.01。

組別A組B組C組D組治療前治療后治療前治療后治療前治療后治療前治療后NO（U/mL）165.39±5.52123.11± 5.65*△#166.08±7.8295.22±4.42165.53±8.3765.15±3.68166.15±9.89110.94±13.28 ET 108.22±7.06155.54± 6.41*△#113.60±6.58179.43±11.18△#112.95±5.12225.73±8.59111.39±4.70124.61±6.846-Keto-PGF1α 439.80±9.74351.16±17.46△#441.54±13.21305.98±18.80#433.80±16.91266.01±15.36437.66±7.53403.03±13.56 TXB2267.99±10.55384.64±18.95*△#275.37±12.37533.37±26.29#272.74±9.27620.70±20.26270.76±11.59343.25±27.94

2.2 電鏡觀察結(jié)果 A組內(nèi)皮下有脂質(zhì)沉積，內(nèi)膜不平，中膜平滑肌細(xì)胞之間均有脂質(zhì)空泡，但與B組及C組相比數(shù)量較少。B組內(nèi)皮結(jié)構(gòu)不完整，平滑肌細(xì)胞間有少量的泡沫細(xì)胞，數(shù)量較C組減少。C組未見(jiàn)完整的內(nèi)皮結(jié)構(gòu)，下有脂質(zhì)沉積形成的脂質(zhì)空泡，大量的脂滴堆積，平滑肌細(xì)胞間均有脂質(zhì)空泡，部分細(xì)胞中出現(xiàn)大量次級(jí)溶酶體和空泡，中膜形成的脂質(zhì)空泡較內(nèi)膜增加。D組正常髂股動(dòng)脈部血管組織內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)，細(xì)胞形態(tài)完整，中膜層未見(jiàn)明顯的泡沫細(xì)胞。見(jiàn)圖1。

3 討論

一氧化氮（NO）和內(nèi)皮素（ET）是兩種最重要的內(nèi)皮源性血管活性因子。ET是具有血管調(diào)節(jié)作用的重要血管活性肽，有強(qiáng)大的收縮血管、促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)積聚、加速生長(zhǎng)因子、黏附分子等合成與釋放及其調(diào)節(jié)其他基因表達(dá)等多種生物學(xué)作用。NO為重要的擴(kuò)血管物質(zhì)，乙酰膽堿、緩激肽、組胺等的舒血管作用均由其介導(dǎo)，可抑制血栓形成，改善血管重塑，刺激內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)等[2]。ET/NO的平衡對(duì)全身和局部血流調(diào)節(jié)起著十分重要的作用，該比值的失衡與動(dòng)脈粥樣硬化（AS）的發(fā)生有關(guān)[3]。

再者，血小板合成的TXB2具有強(qiáng)烈的收縮血管和促進(jìn)血小板聚集的作用，而由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成的前列環(huán)素（PGI2）則作用完全相反，這一對(duì)相互拮抗物質(zhì)的平衡調(diào)節(jié)，影響甚至決定著血管內(nèi)皮細(xì)胞和血小板的關(guān)系，兩者的平衡失調(diào)是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的重要。本實(shí)驗(yàn)研究表明，化濁通脈散具有升高NO、6-K及降低ET、TXB2的作用，NO/ET調(diào)節(jié)其動(dòng)態(tài)平衡，減少血管收縮與血小板凝聚，從而達(dá)到抗AS的作用。

在本實(shí)驗(yàn)中形成的家兔AS斑塊病變，有增殖的平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等。平滑肌細(xì)胞形成的結(jié)締組織基質(zhì)，包括膠原、糖蛋白、彈力纖維蛋白。積蓄的脂質(zhì)主要是游離或酯化的膽固醇，周圍被基質(zhì)包繞等典型改變[4]。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，TEM觀察發(fā)現(xiàn)A組，內(nèi)膜不平，平滑肌細(xì)胞之間有少量的脂質(zhì)空泡，但與B組及C組相比，中藥干預(yù)優(yōu)于后兩者，說(shuō)明化濁通脈散對(duì)預(yù)防脂質(zhì)沉積及修復(fù)破損內(nèi)皮細(xì)胞有一定療效。

ASO屬中醫(yī)學(xué)“脈痹”、“脫疽”等范疇，其病發(fā)生多與痰濁凝滯、氣虛血瘀有關(guān)?！鹅`樞·營(yíng)衛(wèi)生會(huì)》有云:“老者之氣血衰，其肌肉枯，氣道澀?！比说街欣夏辏?dú)獠蛔?，臟腑功能減退，加之外邪、膏粱傷之、思慮過(guò)度，而易生痰成飲，無(wú)力運(yùn)化，阻滯脈道，氣血運(yùn)行受阻，肢體失于溫煦、濡養(yǎng)而出現(xiàn)發(fā)涼、麻木、跋行、疼痛、甚至潰瘍、壞疽的表現(xiàn)。王清任《醫(yī)林改錯(cuò)》中云:“元?dú)饧忍摚夭贿_(dá)于血管，血管無(wú)氣，必停而留瘀。”可見(jiàn)氣虛、血瘀、痰濁貫穿本病發(fā)病的全過(guò)程。因此在治療上以益氣活血、化濁通脈為大法[5]，組成化濁通脈散，重在活血而不破血，益氣而不補(bǔ)氣；益氣充其年老體虛，活血通其經(jīng)脈，化濁祛其痰瘀，通過(guò)培植自身正氣調(diào)動(dòng)人體各項(xiàng)功能，達(dá)到扶正祛邪、治病求本的目的。本方重用黃芪益氣，推動(dòng)氣血運(yùn)行，并激發(fā)臟腑功能活動(dòng)，使氣血生化有源；當(dāng)歸重在養(yǎng)血活血祛瘀通脈；兩藥合用可宣通氣血共為君藥。地龍、水蛭、紅花、赤芍活血散瘀通經(jīng)，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究具有抗凝作用，防止血栓形成；澤瀉、焦山楂泄?jié)窕瘽?，有降血脂作用，兩組共為臣藥。牛膝引藥下行直通下肢，兼以活血，為左使藥；全方共奏益氣活血、化濁通脈之功效。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)化濁通脈散具有防治ASO的作用。

[1] 徐淑云，卞如濂，陳 修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：202-203.

[2] 周京紅.一氧化氮和動(dòng)脈粥樣硬化[J].生物技術(shù)通訊，2007，05(08):879-881.

[3] 薛迎生，王景峰，聶如瓊，等.四逆湯對(duì)兔球囊損傷后血管平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J].中國(guó)病理生理雜志，2004，20(4):603－608.

[4] Ross R.The pathogenesis of atherosclerosis：a perspective for the 1990s[J].Nature，1993，362：801-801.

[5] 楊愛(ài)東，郭永潔，余 星，等.益氣活血通脈顆粒對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型家兔NO、ET、bFGF的影響[J].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2003,17(1):51-53.