金黃膏外敷治療糖尿病潰瘍的實(shí)驗(yàn)研究*

王 軍，楊 瑞，袁向科，徐 陽(yáng)，嚴(yán)豪杰，付 贏

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院外科，天津 300193）

糖尿病潰瘍是常見(jiàn)的糖尿病慢性合并癥之一，是導(dǎo)致糖尿病病人截肢致殘的主要原因，其病、生理機(jī)制涉及高血糖、蛋白質(zhì)非酶糖基化、缺氧、山梨醇通路、肌醇耗竭、神經(jīng)血流減少等諸多因素。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究金黃膏在促進(jìn)創(chuàng)面愈合時(shí)的分子機(jī)制，闡述中藥治療糖尿病難愈性潰瘍的作用機(jī)制。為臨床使用外用藥治療糖尿病難愈性潰瘍提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)及理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠100只，金黃膏、凡士林，精蛋白鋅胰島素注射液，多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)、SP免疫組化試劑盒、濃縮型3，3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑試劑盒、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）、一抗兔抗鼠 CD34。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立與分組 100只SD大鼠按150 mg/kg劑量，注射四氧嘧啶將96只隨機(jī)血糖值＞16.7 mmol/L的糖尿病大鼠做背部皮膚潰瘍?cè)炷ぁｋS機(jī)分為A-金黃膏組，B-胰島素組，C-凡士林組。分別以不同藥物紗條覆蓋創(chuàng)面，無(wú)菌紗布包扎，換藥1次/d，持續(xù)3周，直到創(chuàng)面愈合。

1.2.2 標(biāo)本采集及制備 于第3、7、14、21天，各組分別取8只大鼠，用10%的水合氯醛麻醉。備皮后常規(guī)消毒鋪巾，取各組動(dòng)物創(chuàng)面組織備檢各指標(biāo)。術(shù)后將大鼠處死。

1.2.3 病理學(xué)檢測(cè)成纖維細(xì)胞數(shù)及新生毛細(xì)血管數(shù)蘇木-伊紅（HE）染色，光鏡下，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)在創(chuàng)面中心及創(chuàng)緣四周選擇5個(gè)高倍視野,計(jì)數(shù)肉芽組織中成纖維細(xì)胞數(shù)和新生毛細(xì)血管數(shù),并求其均值。

1.2.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)VEGF及CD34 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子工作濃度1∶100，在Image-Pro Plus多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)上顯微鏡觀察：選擇實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的陽(yáng)性和陰性組織相、進(jìn)行400×的顯微照相。圖像分析：選擇有意義的組織相，經(jīng)登錄、編號(hào)、采集、分析、讀取數(shù)據(jù)、最后存盤。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較檢驗(yàn)，若正態(tài)分布用單因素方差分析，若偏態(tài)分布采用秩和檢驗(yàn)，用P<0.05表示差別有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 肉芽組織中成纖維細(xì)胞及新生毛細(xì)血管數(shù)量的比較 傷后3、7、14、21 d成纖維細(xì)胞數(shù)、新生毛細(xì)血管數(shù)檢測(cè)：A組創(chuàng)面與B組及C組相比較，有顯著性差異（P＜0.01）。而B組和C組組之間無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

2.2 各組CD34水平的比較 A組、B組、C組3組潰瘍創(chuàng)面均可檢測(cè)到CD34。治療后第7天CD34值達(dá)到高峰，隨著傷口的愈合CD34值較前減小，3組比較有顯著差異（P＜0.05）。

2.3 各組VEGF水平的比較 A組和B組均能顯著地促進(jìn)機(jī)體分泌VEGF。A組在第3、7、14、21天，VEGF 的 IHS 值分別為 4.12±1.24，7.37±2.44、4.87±1.64 及 2.62±0.91，并與 B 組及 C 組相比較，均有顯著性差異（P＜0.05）。見(jiàn)表 1。

3 討論

金黃膏是由金黃散和麻油制成的軟膏劑型。金黃散是《醫(yī)宗金鑒》里的經(jīng)方，文獻(xiàn)記載有清熱除濕、散瘀化痰、止痛消腫的作用，由大黃、黃柏、姜黃、白芷、天南星、陳皮、蒼術(shù)、厚樸、甘草、天花粉等藥物組成。研究證實(shí)金黃膏及其提取液均有較強(qiáng)的抑菌作用；能夠提高傷口分泌物和外周血中溶菌酶含量；具有激活巨噬細(xì)胞和增強(qiáng)其吞噬功能的作用。

表1 治療后成纖維細(xì)胞數(shù)、新生毛細(xì)血管數(shù)、CD34、VEGF比較(±s)Tab.1 Comparison of the number of fibroblasts,the number of new blood capillaries,CD34,VEGF after treatment(±s)

表1 治療后成纖維細(xì)胞數(shù)、新生毛細(xì)血管數(shù)、CD34、VEGF比較(±s)Tab.1 Comparison of the number of fibroblasts,the number of new blood capillaries,CD34,VEGF after treatment(±s)

注：▲P＜0.01，★P＜0.01，◆P＜0.05 ，■P＜0.05。

組別n 成纖維細(xì)胞數(shù)新生毛細(xì)血管數(shù)金黃膏組胰島素組凡士林組8883 d 24.8±5.7918.7±4.14▲16.6±3.83▲7 d 55.89±6.8843.65±4.23▲40.23±5.34▲14 d 4.8±8.7130.46±6.2▲28.34±7.3▲21 d 15.78±2.7813.25±1.46▲11.12±1.46▲3 d 7.01±2.204.87±1.14★3.76±0.83★7 d 14.89±3.889.65±3.23★8.13±2.34★14 d 9.78±1.326.33±1.21★5.92±1.30★21 d 5.38±1.784.45±1.46★3.12±1.56★組別n CD34VEGF金黃膏組胰島素組凡士林組8883 d 5.71±1.793.25±0.881.12±0.837 d 9.28±1.884.80±1.24◆1.75±0.70◆14 d 4.71±1.253.01±0.92◆0.87±0.35◆21 d 2.42±0.781.25±0.460.62±0.513 d 4.12±1.243.12±0.83■1.37±1.18■7 d 7.37±2.444.50±1.30■2.25±1.03■14 d 4.87±1.642.62±0.91■1.37±0.91■21 d 2.62±0.911.12±0.83■0.87±0.64■

據(jù)本研究結(jié)果初步推測(cè)金黃膏促進(jìn)糖尿病難愈性潰瘍愈合的主要機(jī)制有以下幾點(diǎn)。

3.1 促進(jìn)肉芽組織生成 豐富的新生毛細(xì)血管能充實(shí)肉芽組織且改善創(chuàng)面微循環(huán)，為組織修復(fù)提供所必須的氧及豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有利于傷口愈合；纖維母細(xì)胞又是創(chuàng)傷修復(fù)最主要的細(xì)胞。成纖維細(xì)胞的功能和形態(tài)及細(xì)胞周圍環(huán)境的變化在很大程度上影響著創(chuàng)面愈合的進(jìn)程[1]。創(chuàng)傷形成后，纖維母細(xì)胞發(fā)生增殖、遷移，并合成、分泌膠原和胞外基質(zhì)（蛋白質(zhì)）成分，參與肉芽組織形成、創(chuàng)口收縮及組織重建的過(guò)程，其數(shù)量變化會(huì)對(duì)創(chuàng)傷愈合產(chǎn)生巨大影響[2]。本研究表明金黃膏能明顯提高創(chuàng)面新生毛細(xì)血管數(shù)，顯示金黃膏能改善創(chuàng)面微循環(huán)，加速組織修復(fù)過(guò)程。同時(shí)金黃膏能顯著提高創(chuàng)面肉芽組織中成纖維細(xì)胞數(shù)量，并能促進(jìn)成纖維細(xì)胞成熟生成膠原纖維、彈性纖維、網(wǎng)狀纖維及基質(zhì)成分，從而促進(jìn)傷口愈合。

3.2 促進(jìn)生長(zhǎng)因子的分泌 研究表明[3]該因子對(duì)糖尿病足潰瘍的治愈與降低截肢率有顯著效果。CD34為黏蛋白樣血管遞質(zhì)素的一種，主要表達(dá)于多能造血干細(xì)胞、定向祖細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、和血管內(nèi)皮細(xì)胞[5]，可以根據(jù)創(chuàng)面CD34表達(dá)作為新生血管形成的量化指標(biāo)。本研究可見(jiàn)金黃膏顯著促進(jìn)機(jī)體分泌VEGF來(lái)加快肉芽組織的形成及加快創(chuàng)面愈合，并在金黃膏組肉芽組織中檢測(cè)CD34顯著增多，說(shuō)明金黃膏可以顯著地促進(jìn)機(jī)體分泌CD34來(lái)加快肉芽組織的形成及加快創(chuàng)面愈合。

3.3 保護(hù)和濕潤(rùn)創(chuàng)面作用 金黃膏軟膏接觸創(chuàng)面部分受皮溫液化為液體，經(jīng)與創(chuàng)面物質(zhì)反應(yīng)變化后，在創(chuàng)面形成一層黃色的保護(hù)膜屏障，阻斷細(xì)菌所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝入、同時(shí)可加快表皮細(xì)胞遷移速度、維持創(chuàng)面正常的電勢(shì)梯度、促使更多的生長(zhǎng)因子受體與生長(zhǎng)因子結(jié)合等，這些都能改善創(chuàng)面局部循環(huán)，提高局部血流量，增強(qiáng)局部組織免疫功能，使壞死組織液化，終將促進(jìn)創(chuàng)面愈合[6]。

本研究發(fā)現(xiàn)金黃膏組使創(chuàng)面愈合時(shí)間縮短，經(jīng)病理及免疫檢測(cè)發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面新生毛細(xì)血管數(shù)及成纖維細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組增加，瘡面愈合早期VEGF及CD34表達(dá)增加。本研究檢測(cè)到金黃膏組肉芽組織中CD34表達(dá)增加，說(shuō)明新生毛細(xì)血管數(shù)增加。金黃膏組肉芽組織中VEGF呈坡峰狀顯著增多，說(shuō)明金黃膏促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)制可能是通過(guò)促進(jìn)機(jī)體早期分泌VEGF來(lái)加快肉芽組織的形成從而加快創(chuàng)面愈合。

[1] 肖正華，張正軍，周 倩，等.糖尿病足部潰瘍患者白介素-1對(duì)成纖維細(xì)胞增殖及基質(zhì)金屬蛋白酶-2和基質(zhì)金屬蛋白酶-9的影響[J].中國(guó)慢性病預(yù)防與控制，2008，16（6）：581-583.

[2] 秦全江.成纖維細(xì)胞在皮膚創(chuàng)傷愈合中的作用及其調(diào)控[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)：創(chuàng)傷與外科基本問(wèn)題分冊(cè)，2000，12(1)：33-33.

[3] Huang P,Li S,Han M,et a1.Autologous transplantation of granulocyte colony-stimulating fact ormobilized peripheral blood mononuclear cells improves critical limb ischemia in diabetes[J].Diabetes Care,2005,28(9):2155-2160.

[4] 張煒沂，陳 虎.CD34分子介導(dǎo)黏附作用的研究進(jìn)展[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，25（5）：533-535.

[5] 劉淑蘭，梁艷華.濕性理念加整體干預(yù)治療1例放射性傷口的效果觀察[J].創(chuàng)傷外科雜志，2009,11(1)：92-93.