腹腔植入化療對大鼠結腸吻合口愈合影響的實驗研究

楊廣令,張俊華*,張銀旭,周曉敏

(1遼寧醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院,遼寧錦州 121000;2遼寧醫(yī)學院)

結直腸癌根治術后 5 a復發(fā)率高達 50%,如何 防治結直腸癌術后局部復發(fā)及肝臟轉(zhuǎn)移是提高其臨床療效的關鍵所在[1]。氟尿嘧啶(Fu)植入劑(中人氟安)是一種新型的緩釋型化療藥物,能夠在給藥區(qū)域較長時間維持較高的、穩(wěn)定的藥物濃度,有利于殺死沒有切除的亞臨床病灶、微小轉(zhuǎn)移灶及腹腔內(nèi)的游離癌細胞,但是在殺死腫瘤細胞的同時會不會對機體產(chǎn)生不良影響尚缺乏一定的基礎研究。2009年 5～6月我們通過建立大鼠結腸吻合口模型以探討腹腔植入中人氟安對大鼠全身及吻合口愈合的影響,為臨床應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年雄性大鼠 60只,體質(zhì)量 200～250 g,由遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑和器械 5-氟尿嘧啶(5-Fu)注射液,Fu植入劑,考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒和羥脯氨酸測試盒(消化法)(南京建成生物工程研究所),抗Ⅰ、Ⅲ膠原纖維抗體(北京博奧森生物技術有限公司),KT 6180全自動血液細胞分析儀,全自動生化儀,菁華 754紫外可見分光光度計,CH-20光學顯微鏡。

1.3 動物模型制備、分組與處理 大鼠術前禁食12 h,術后自由飲水、12 h后少量進食。2%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后腹部消毒,在劍突下 1 cm處取長約 3 cm腹正中切口切除約 1 cm結腸,吻合腸管后逐層關腹。術畢將 60只大鼠隨機分為 A、B、C 3組,每組 20只,組內(nèi)再隨機分為兩個亞組各 10只。A組:術后 24 h腹腔注射生理鹽水(NS)20m l/(kg? d),連用 5 d;B組:腹腔注射 5-Fu 20 ml/(kg? d)+NS 20m l/(kg? d),連用 5 d;C組:術中在距吻合口約 1 cm外的漿膜層和腸系膜一次性植入中人氟安 20 mg/kg,其中第 1亞組 2只大鼠腸壁上分別固定 3和 6粒中人氟安(約占總藥量的 33%和 50%),第 2亞組 1只在距吻合口約 0.7 cm、另 1只在大鼠腸系膜中供應吻合口的血管旁分別固定 5粒中人氟安。A、B、C組均在術后第 7天處死第 1亞組,第 14天處死第 2亞組。

1.4 觀察指標

1.4.1 一般狀況 觀察各組大鼠的飲食情況、活動、反應、精神狀態(tài)和腹部切口愈合情況等,治療期間對死亡大鼠進行解剖以明確死亡原因。于術后第7天剖腹后觀察腹腔和吻合口的大體形態(tài),并根據(jù)van der Ham等[2]方法進行評分:0分:無粘連;1分:輕度粘連(主要在吻合口和網(wǎng)膜之間);2分:中度粘連(吻合口和小腸之間,吻合口兩側與網(wǎng)膜粘連);3分:重度粘連(吻合口周圍形成膿腫)。

1.4.2 血常規(guī)(Rt)及肝、腎功能指標 術后第 7天和第 14天處死大鼠的同時抽下腔靜脈血 5 ml,測試 Rt和肝、腎功能。

1.4.3 吻合口破裂壓(ABP) 剖腹后在距吻合口兩端各 3 cm處結扎腸袢,腸袢一端與微量輸液泵連接,另一端通過壓力換能器連接電腦,通過 LMS-2B型二道生理記錄儀描記壓力曲線。輸液泵以 2m l/min速度向腸管內(nèi)注入亞甲藍溶液,觀察到壓力曲線突然下降時即 ABP。

1.4.4 羥脯氨酸(HYP)測定 以吻合口為中心切取長 0.5 cm的腸壁,除凈粘連的組織后稱取濕重為40～100mg的組織放入 EP管中,徹底粉碎后分別按考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒和 HYP試劑盒說明進行操作。

1.4.5 病理組織學檢查 吻合口組織常規(guī)石蠟包埋、切片,做免疫組織化學染色后顯微鏡觀察并做圖像分析,結果取像素和面積平均后的乘積。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析處理。所有數(shù)據(jù)以±s表示,多個樣本間總體率的比較用 χ2檢驗,多個樣本均數(shù)間兩兩比較用最小有意義差異法(LSD法)。以 P≤0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 一般情況 3組動物術后 12 h后恢復進食,大鼠活動力均恢復正常,對外界刺激反應略遲鈍,精神可。A組無死亡;B組兩個亞組分別發(fā)生吻合口漏 4只,死亡 8只;C組第 1亞組發(fā)生腸穿孔 2只,第 2亞組發(fā)生吻合口漏 2只,死亡 4只。各組間死亡率比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。術后第 7天 A、B、C組吻合口評分分別為 3、12、5分,B組高于 A、C組(P＜0.05)。

2.2 Rt及肝、腎功能 術后各組間 Rt結果比較見表 1。術后第 7天各組間血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)等比較均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。

表1 三組術后大鼠 Rt結果比較(×109/L,±s)

表1 三組術后大鼠 Rt結果比較(×109/L,±s)

注:與A組比較,*P＜0.05;與 C組比較,△P＜0.05

組別 WBC第 7天 第 14天RBC第 7天 第 14天PLT第 7天 第 14天A組 3.84±0.60△ 1.35±0.23△ 2.46±0.19 2.45±0.24 154.80±86.00 149.30±69.84 B組 0.82±0.29*△ 7.90±3.28*△ 1.64±0.66*△ 2.42±0.31 56.17±42.51*△ 148.50±61.59 C組 6.65±3.14* 3.21±0.32* 2.25±0.12 2.41±0.16 157.88±86.92 149.38±54.06

2.3 ABP和 HYP 術后三組 ABP和 HYP水平比較見表 2。

表2 三組術后 ABP和 HYP水平比較(±s)

表2 三組術后 ABP和 HYP水平比較(±s)

注:與 B組比較,*P＜0.01

組別 ABP(mmHg)第 7天 第 14天HYP(μg/mgprot)第 7天 第 14天A組 129.86±2.78*135.72±0.63 3.45±0.40*4.14±0.30 B組 80.37±25.29 130.90±1.60 2.88±0.36 3.82±0.29 C組 124.48±4.81*132.33±6.54 3.32±0.40*3.98±0.24

2.4 病理組織學 術后第 7天吻合口有增生的毛細血管和大量呈梭形的成纖維細胞,組織較疏松,并可見炎細胞浸潤;術后第 14天吻合口由大量膠原纖維組成,血管及細胞成分較術后第 7天減少,組織較致密,可見瘢痕表面有腺體細胞生成。Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維呈棕黃色顆粒狀或片狀,顯色均在細胞質(zhì)和膠原特定的區(qū)域,各組Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維含量比較見表 3。

表3 三組術后Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維含量比較(±s)

表3 三組術后Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維含量比較(±s)

注:與 A組比較,*P＜0.01;與 B組比較,△P＜0.01

組別 Ⅰ型膠原纖維第 7天 第 14天Ⅲ型膠原纖維第 7天 第 14天A組 1.68±0.10 2.60±0.26 1.48±0.11 2.31±0.19 B組 1.18±0.11*2.54±0.19*1.16±0.10*2.24±0.16*C組 1.53±0.08△ 2.57±0.23△ 1.44±0.09△ 2.28±0.17△

3 討論

多數(shù)實驗研究認為術后早期腹腔化療干擾傷口的正常愈合[3]。腸吻合口愈合時,結合力的強度主要依賴于黏膜下層的膠原纖維量[4],其中HYP在膠原中的含量較為穩(wěn)定,約占膠原氨基酸總量的 14%,是膠原纖維的特征性氨基酸,通過對創(chuàng)面 HYP含量的測定可了解創(chuàng)面膠原合成及轉(zhuǎn)運情況。而 ABP則為腸內(nèi)壓上升致使吻合口破裂時的壓力,直接反映吻合口的抗張強度。腸吻合口愈合強度取決于膠原纖維合成與降解的平衡,腸吻合口愈合需要不同時間點的動態(tài)觀察,單一時間點的測定結果可能得出相左的實驗結論[5]。

實驗證實 5-Fu對消化道腫瘤有確切療效,且5-Fu的療效有明顯的時間依賴性即作用時間越長療效越好。中人氟安為 Fu的固體緩釋植入劑,植藥 10 d內(nèi)血藥濃度可持續(xù) 0.1μg/m l以上,克服了 5-Fu半衰期短和短時間內(nèi)血液濃度高所導致的不良反應。鑒于此本實驗選擇兩個時間點,利用5-Fu按照 Sugarbaker提出的術后 24 h起連續(xù) 5 d給藥的早期腹腔化療與 Fu植入劑術中植入化療進行對比,以驗證固體緩釋植入劑的安全性。本實驗根據(jù)實驗動物與人的藥物劑量換算方法[6],應用 5-Fu和 Fu植入劑均為 20 mg/(kg?d)。治療期間 B組發(fā)生吻合口漏 8例,均死亡,說明大劑量腹腔化療使吻合口浸潤在高藥物濃度中,同時藥物可以被腹膜很快吸收入血液,使血藥濃度形成瞬時峰值,影響吻合口細胞生長,進而影響吻合口早期愈合。C組有 2例大鼠腸穿孔,腸壁單點植藥量約占總藥量的 33%和 50%,2例吻合口漏,說明 Fu植入劑植入不易距吻合口太近,同時單點植入不易過多,特別是大的血管旁和腸壁,以免引起潰瘍而導致穿孔或血管破裂出血,同時在供應吻合口的血管旁亦不易植入過多,以防影響吻合口愈合。

術后第 7天 B組大鼠體質(zhì)量略有減輕,剖腹后見 B組腹腔粘連較重,個別大鼠出現(xiàn)腹繭癥[7],吻合口評分較高,說明大劑量 5-Fu腹腔化療能在組織周圍和血液里形成瞬時高的藥物濃度,干擾結腸吻合口成纖維細胞及其他正常細胞的生成,故吻合口脆性較大、抗拉強度低、ABP和 HYP均很低,吻合口漏發(fā)生率增加。C組腹腔粘連較輕,對骨髓抑制及吻合口周圍的成纖維細胞和其他正常細胞影響不明顯,吻合口能抵抗一定拉力,ABP和 HYP與 A組相差不大。A、C組 WBC計數(shù)比較高,C組最高,說明 C組除結腸和腹壁吻合口中的線結和壞死組織細胞引起的炎癥外,Fu植入劑藥粒本身也會引起無菌性炎癥,同時它也能使植藥周圍的細胞不斷死亡,需要更多的 WBC清除。B組則因大劑量 5-Fu腹腔化療引起骨髓抑制導致全血細胞減少。術后第 14天 B組 WBC計數(shù)最高,表明化療藥物結束后骨髓抑制狀態(tài)解除,造血系統(tǒng)恢復造血,同時吻合口周圍和造血系統(tǒng)有大量壞死組織、細胞和(或)不成熟細胞,加上線結引起的炎癥,使 WBC增多,同時大劑量化療藥使腹腔粘連較重,部分結腸處于不完全梗阻狀態(tài),也是WBC增多的原因。C組較第 7天降低,說明吻合口部位所引起的炎癥已經(jīng)消退,且 Fu植入劑藥力減弱,周圍死亡細胞減少,為藥粒形成的輕微炎癥反應所致。除 WBC外,3組 RBC、PLT、ABP、HYP和Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維含量均高于術后第 7天,說明大劑量 5-Fu術后早期腹腔化療影響結腸吻合口早期愈合,增加腸吻合口瘺發(fā)生率,但并不降低后期結腸吻合口的抗張力強度。而 Fu植入劑術后用于腹腔化療并不影響結腸吻合口的早期愈合,不增加腸吻合口瘺的發(fā)生率,且不會引起肝、腎損害,為防治結直腸癌術后轉(zhuǎn)移和復發(fā)提供了一種安全、可行的輔助化療方法。

[1]張森,萬德森,潘志忠,等.結直腸癌肝轉(zhuǎn)移的多因素分析[J].中華腫瘤雜志,2002,24(4):367-369.

[2]van der Ham AC,KortWJ,Weijma IM,etal.Effect of antibiotics in fibrin sealant on healing colonic anastomoses in the rat[J].Br J Surg,1992,79(6):525-528.

[3]張衛(wèi),韓文妙,郁解非.結腸吻合口愈合的實驗研究及其進展[J].國際外科學雜志,1990,2:88-91.

[4]J?nsson K,Jiborn H,Zederfeldt B.Collagen metabolism in small intestinal anastomosis[J].Am JSurg,1987,154(3):288-291.

[5]Makrin V,Lev-Chelouche D,Even SE,etal.Intraperitoneal heated chemotherapy affects healing ofexperimental colonic anastomosis:an animal study[J].JSurg Oncol,2005,89(1):18-22.

[6]施新遒.醫(yī)用實驗動物學[M].西安:陜西科學技術出版社,1989:429-432.

[7]王罡,張俊華,楊廣令,等.原發(fā)性腹繭癥致腸穿孔 1例分析[J].中國當代醫(yī)藥,2009,16(12):53-54.