張謹華 ，王 鑫

（1.晉中學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山西晉中030600；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

利用微生物的降解作用是清除環(huán)境中芳香族化合物污染的有效途徑之一[1]。而固定化微生物技術(shù)是可將游離細胞定位于材料的限定空間中，并使其保持生物活性且可反復(fù)利用的生物技術(shù)。由于它具有生物濃度易控制、耐毒害能力強、菌種流失少、產(chǎn)物易分離、運行設(shè)備小型化等特點，應(yīng)用在水處理和生物生產(chǎn)領(lǐng)域中，近年來已成為各國學(xué)者研究的熱點[2]。但是，由于固定化材料性能的諸多不足，固定化微生物技術(shù)的工程應(yīng)用受到很大的限制，因此，研制優(yōu)質(zhì)的固定化材料勢在必行[3]。

本研究通過選取未經(jīng)固定化微生物處理的苯酚廢水濃度，采用3種包埋固定化載體作為細菌固定化材料，一種是最優(yōu)良的凝固劑瓊脂，是凝膠包埋法中常用的載體；一種是海藻酸鈉，可作為天然高分子載體材料的代表；一種是人工合成的高分子載體材料PVA。分別就3種材料作不包埋微生物的固定化顆粒小球的比較試驗研究，確定最佳包埋材料，并在此基礎(chǔ)上優(yōu)化選擇包埋條件。

由于制作包埋微生物的固定化顆粒需要對微生物進行培養(yǎng)、離心、作靜息細胞，因此本試驗嘗試采用不包埋微生物的固定化顆粒來選擇包埋材料以簡化實驗操作。

1 材料和方法

1.1 材料

瓊脂、海藻酸鈉（SA）、聚乙烯醇（PVA 1799+50 AR）均購自華美生物工程公司。

菌種苯酚降解菌Rhodoccocus sp DF51，由山西大學(xué)生物技術(shù)研究所化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點實驗室篩選并保存。

1.2 配制合成廢水

NH4NO30.8 g，KH2PO40.4 g，MgSO4·7H2O 0.15 g，酵母膏 0.2 g，CaCl2·2H2O 0.02%（W/V），F(xiàn)eSO4·7H2O0.000 2 g，苯酚 0.8 g，蒸餾水 1 L。pH為6.4。

1.3 制作不包埋微生物的固定化顆粒小球

先配制一定濃度的載體溶液（即4%的純瓊脂水溶液（降溫到45℃待用）、3%的海藻酸鈉、10%的PVA載體溶液），用預(yù)熱的無菌20 mL注射器針筒（9號針頭）分別加壓滴入相應(yīng)的無菌交聯(lián)劑溶液中（即液體石蠟油、4%CaCl2水溶液、飽和H3BO3）。交聯(lián)16 h，制成固定化顆粒小球，用生理鹽水洗滌3次，放入4℃冰箱備用[4]。

1.4 比較3種固定化載體的性能

選用20粒粒徑大小相同的瓊脂小球、海藻酸鈉小球和PVA小球，分別浸入裝有50 mL合成廢水的三角瓶中，放入恒溫搖床上作振蕩培養(yǎng)（250 r/min，30℃），30 min時測定苯酚殘余量（苯酚含量的測定采用4-氨基安替比林比色法[5]），計算不同材料對苯酚的吸附性能（吸附性能=30 min時苯酚含量/0時苯酚含量×100%）。24 h時觀察小球的穩(wěn)定性與合成廢水的渾濁度。

1.5 靜息細胞

自斜面培養(yǎng)基上挑一環(huán)菌接入20 mL初始苯酚濃度為0.2 g/L的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，30℃下，200 r/min培養(yǎng)36 h。然后以5%的接種量轉(zhuǎn)接至50 mL初始苯酚濃度為0.5 g/L的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，2次活化36 h。再以10%的接種量轉(zhuǎn)接至初始苯酚濃度為0.8 mg/L基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h至對數(shù)生長期中后期。最后，在4℃，8 000 r/min下，離心10 min。離心收集到的菌體經(jīng)磷酸緩沖液（0.02 mol/L，pH 7.0）洗滌 2次后，懸浮在該磷酸緩沖液中，制備成不同細胞濃度的菌懸液。

1.6 固定化細胞的制備，確定海藻酸鈉作為載體材料的最佳固定化條件

將制成的菌體干質(zhì)量濃度為4.4 g/L的菌懸液在4℃下保存。稱取適量的海藻酸鈉（SA）置于沸水中攪拌使其充分溶解，然后冷卻至室溫，滅菌。取一定體積的菌懸液和SA溶液混合均勻，使用滅菌過的注射器借助微型注射泵在磁力攪拌狀態(tài)下將其滴加于一定濃度的CaCl2沉淀劑中，根據(jù)溶液的黏度調(diào)整微型注射泵的流速和注射器高度得到相同大小的球狀顆粒，交聯(lián)充分后，用無菌生理鹽水清洗2～3次，4℃保存。

2 結(jié)果與分析

選用3種載體制作固定化顆粒進行比較試驗，結(jié)果列于表1。

表1 3種固定化載體的相對比較

由表1可知，瓊脂、海藻酸鈉顆粒在30 min內(nèi)對苯酚的吸附性能較高，都有較好的傳質(zhì)性能，而PVA的吸附性能相對較低；瓊脂顆粒穩(wěn)定性差，振蕩培養(yǎng)24 h后全部破碎，且使合成廢水變渾濁，固液不能分離，不能重復(fù)使用。綜合考慮固定化載體的各項特性得出，海藻酸鈉為固定化微生物處理苯酚廢水的最好包埋材料。

為確定海藻酸鈉作為載體材料最適宜的包埋條件，選擇載體（海藻酸鈉）濃度、菌體與載體濃度之比、交聯(lián)劑（CaCl2）濃度為影響因素，每個因素選取3個水平，以正交設(shè)計來確定試驗方案，各因素與水平的組合如表2所示。此方案中的各種固定化微生物在相同條件下對苯酚進行降解，結(jié)果表明，紅球菌降解苯酚的最佳固定化條件是方案4，即載體濃度為3%，菌體與載體濃度之比為1∶10，交聯(lián)劑濃度為3%。此條件下的固定化細胞不僅降解率最高，而且機械強度和韌性也最好。進一步對方案4不同的交聯(lián)時間（h）進行試驗，結(jié)果表明，交聯(lián)時間在10 h以內(nèi)的機械性能較差，而16 h以上的交聯(lián)時間，固定化細胞機械強度較好。

表2 不同因素對固定化紅球菌降解苯酚的影響

3 結(jié)論與討論

本試驗選取目前固定化微生物包埋技術(shù)中應(yīng)用最廣、效果較好的載體材料，采用經(jīng)典的最適宜的包埋條件，從經(jīng)濟和效率角度分析，對不包埋微生物的固定化顆粒進行探索性比較試驗。結(jié)果顯示，海藻酸鈉具有制備容易、價格低廉、穩(wěn)定性較好、傳質(zhì)性能良好的優(yōu)點，可作為最好的包埋材料。固定化生物技術(shù)是通過化學(xué)或物理的手段，將游離細胞或酶定位于限定的空間區(qū)域內(nèi)，使其保持活性并可反復(fù)利用[6]?；罴毎潭ɑ夹g(shù)由于能簡化酶的提取，有效提高酶對溫度、底物、溶劑和pH等諸因子的適應(yīng)性并能反復(fù)長期使用，有利于實現(xiàn)連續(xù)化、自動化與管道化生產(chǎn)與應(yīng)用，可以大大提高生產(chǎn)效率，具有運行穩(wěn)定、可純化和保持高效優(yōu)勢菌種、反應(yīng)器生物量大、污泥產(chǎn)生量少以及固液分離效果好等一系列優(yōu)點。因而，這一新技術(shù)自20世紀70年代以來首先在發(fā)酵[7]、食品和醫(yī)藥工業(yè)領(lǐng)域得到廣泛的研究與應(yīng)用[8]，到80年代初開始在廢水處理領(lǐng)域中研究與探索[9]。但是，實際廢水是一個復(fù)雜體系，除需要選育適合于它的高效菌株外，更需要選擇固定化微生物處理廢水的包埋材料。進一步選擇使用壽命長、性能好、價格低廉的固定化載體等，是使固定化微生物法能夠真正應(yīng)用于實際廢水處理必須研究解決的問題。

［1］唐渭，蘇鳳，曾曉東.固定化微生物廢水處理技術(shù)及其發(fā)展[J].環(huán)境研究與監(jiān)測，2006，19（1）：8-10.

［2］Bala Kiran，Anubha Kaushik，Kaushik C P.Response surface methodological approach for optimizingremoval of Cr（VI）from aqueous solution usingimmobilized cyanobacterium[J].Chemical EngineeringJournal，2006，23（6）：1-7.

［3］王彩冬，黃兵，羅歡.固定化微生物技術(shù)及其應(yīng)用研究進展[J].云南化工，2007，34（4）：79-82.

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［9］吳光前，王麗萍.固定化微生物廢水處理技術(shù)的現(xiàn)狀和前景[J].污染防治技術(shù)，2003，16（4）：80-83.