丙泊酚對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)突觸傳遞長時(shí)程抑制的作用

李曉強(qiáng)，孫雪華

丙泊酚是臨床常用的靜脈麻醉藥，主要通過易化或直接激活γ-氨基丁酸A型受體（GABAA）發(fā)生作用。臨床研究表明，丙泊酚麻醉后患者會(huì)有幾個(gè)小時(shí)的順行性遺忘、記憶障礙等認(rèn)知功能缺陷[1]，表明丙泊酚影響了學(xué)習(xí)和記憶。突觸傳遞的長時(shí)程增強(qiáng) （long-term potentiation，LTP） 和長時(shí)程抑制（long-term depression，LTD）是在突觸水平研究學(xué)習(xí)和記憶的細(xì)胞模型，因此為了深入探討丙泊酚對(duì)認(rèn)知功能的影響，筆者利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)研究丙泊酚對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)LTD誘導(dǎo)的影響，以期為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性Wistar大鼠（3周齡，由昆明人民醫(yī)院動(dòng)物房提供）。

1.2 主要試劑及儀器 丙泊酚購買于四川蜀樂藥業(yè)股份有限公司（批號(hào) 0405027，200 mg/20 ml），AP-5和Picrotoxin（pic）購買于Sigma公司。所有藥物都經(jīng)循環(huán)液給予。

1.2.1 腦片制備 實(shí)驗(yàn)遵循中科院昆明動(dòng)物研究所的規(guī)定，并取得其同意。取雄性Wistar大鼠，快速斷頭，迅速取出腦置于氧（95%O2～5%CO2）飽和的冰水人工腦脊液中，其成分為（in mM）120 NaCl，2.5 KCl、1.25 NaH2PO4（·2 H2O）、26 NaHCO3、2.0 MgSO4、10 D-glucose、1.19 CaCl2（·2 H2O），氧飽和后，pH7.4。用振動(dòng)切片機(jī)冠狀面切腦片，厚度為400 μm。將腦片放在孵育槽中浸在液面下的尼龍網(wǎng)上，不斷充以混合氣，并置于37℃恒溫水育槽中孵育 1h，然后置于室溫中（22～25 °C），0.5 h 后開始實(shí)驗(yàn)。

54張腦片隨機(jī)分為9組（每組6張），分別為10、30、50、100 μmol/L 丙泊酚組，100 μmol/L 丙泊酚+100 μmol/L pic組，LTD對(duì)照組，LTD丙泊酚組，LTD AP-5對(duì)照組，AP-5+丙泊酚組。

1.2.2 膜片鉗記錄 將腦片移入傳統(tǒng)的記錄槽中，用兩片尼龍網(wǎng)將其固定在中間，置于直立的Nikon顯微鏡（10×10）下，以 3～4 ml/min的速度持續(xù)灌流氧飽和的人工腦脊液。鏡下確定海馬的CA1區(qū)，將刺激電極放在Schaffer纖維，然后以盲插的方式記錄CA1區(qū)錐體細(xì)胞的EPSC，將細(xì)胞鉗制在-70 mv，細(xì)胞電阻穩(wěn)定后才開始記錄。實(shí)驗(yàn)過程中用一個(gè)5mv的電壓持續(xù)監(jiān)測細(xì)胞的輸入阻抗和串形電阻。串形電阻大小一般在10～30 MΩ，只有在基線記錄時(shí)EPSC的變化不超過平均值的20%，記錄全程中細(xì)胞的輸入阻抗（100～300 MΩ）相對(duì)穩(wěn)定，且EPSC的最大值不少于100 pA時(shí)，數(shù)據(jù)才可用于分析。所記錄到的EPSC是單突觸的，因?yàn)樵诓煌拇碳?qiáng)度下同一細(xì)胞的EPSC的潛伏期穩(wěn)定，通常為2～4 ms。

刺激電極由兩股含90%鉑金和10%銥的金屬絲制成，外涂以太氟龍（Teflon），兩股互相纏繞，內(nèi)徑為50 μm，外徑為75 μm。記錄電極用硼硅酸鹽毛細(xì)玻璃管制成（內(nèi)徑0.84 mm，外徑1.5 mm，World Precision Instruments,Inc.USA），當(dāng)充以電極內(nèi)液后其電阻為3～6 MΩ。電極內(nèi)液成分為（in mmol/L）： 130 K-gluconate、10 KCl、10 EGTA、1 CaCl2（·2H2O）、6 NaCl、10 HEPES、3MgATP、0.5NaGTP、5 QX314，用KOH調(diào)pH7.2，滲透壓為321mOsm。電刺激（持續(xù)0.1 ms）頻率為0.05 Hz，取EPSC最大值的50%為準(zhǔn)，記錄10 min基線。然后以低頻刺激（900 pulse，3 Hz）誘導(dǎo)LTD，刺激強(qiáng)度同基線記錄時(shí)。誘導(dǎo)時(shí)將膜電位去極化至-50 mv。

應(yīng)用 Axopatch 200B（Axon Instrument，USA）放大器記錄數(shù)據(jù)，濾波為5 Hz，數(shù)字化為20 Hz。并將數(shù)據(jù)存儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以興奮性突觸后電流（EPSC）幅值的變化來分析。LTD的值以低頻后20～30 min為準(zhǔn)，應(yīng)用Axoscope和Clampfit及Origin等軟件來分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 丙泊酚呈劑量依賴性地抑制興奮性突觸后電流 10 μmol/L和30 μmol/L的丙泊酚對(duì)EPSC無明顯影響，而50 μmol/L和100 μmol/L的丙泊酚則可明顯抑制EPSC（表1），與基線相比，差異顯著（P<0.05）。為驗(yàn)證丙泊酚的作用位點(diǎn)，在循環(huán)液中加入100 μmol/L Picrotoxin（一種GABAA受體阻斷藥），將腦片孵育0.5 h后，再觀察100 μmol/L的丙泊酚的作用，發(fā)現(xiàn)丙泊酚對(duì)EPSC的抑制作用完全被阻斷，而Picrotoxin本身對(duì)EPSC的基線無影響。

表1 不同劑量組丙泊酚大鼠的EPSC（±s）

表1 不同劑量組丙泊酚大鼠的EPSC（±s）

與基線比較,*P<0.05

組別 基線 加藥后10 μM PRO 0.999 7±0.05 1.091 1±0.07 30 μM PRO 1.000 3±0.05 1.001 7±0.08 50 μM PRO 1.000 0±0.03 0.727 5±0.06*100 μM PRO 1.000 3±0.04 0.581 2±0.09*pic+PRO 1.026 3±0.06 1.123 6±0.09

2.2 丙泊酚易化LTD的誘導(dǎo) 當(dāng)給予低頻刺激（3 Hz，900 pulse）后，可誘導(dǎo)出確切的 LTD，與基線相比差異顯著（P<0.05）。取對(duì)基線無影響的最大丙泊酚劑量30 μmol/L，孵育腦片，0.5 h后觀察LTD的誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)30 μmol/L的丙泊酚可誘導(dǎo)出更大的LTD，與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05，表 2）。

2.3 AP-5可以阻斷LTD的誘導(dǎo) 循環(huán)液中加入50 μmol/L的AP-5，一種特異性的NMDA受體拮抗劑，孵育腦片0.5 h，然后觀察對(duì)照組和丙泊酚組LTD的誘導(dǎo)，結(jié)果對(duì)照組和丙泊酚組LTD的誘導(dǎo)均被完全阻斷（表2）。

表2 丙泊酚對(duì)LTD的誘導(dǎo)作用（±s）

表2 丙泊酚對(duì)LTD的誘導(dǎo)作用（±s）

與基線比較，*P<0.05；與對(duì)照組相比，#P<0.05

組別 基線 低頻后25 min對(duì)照組 0.988 2±0.05 0.751 4±0.08*30 μM 丙泊酚組 0.991 1±0.04 0.544 0±0.04*#AP-5 對(duì)照組 1.017 6±0.02 1.078 3±0.07#AP-5+丙泊酚組 1.004 6±0.05 0.989 4±0.04#

3 討 論

γ-氨基丁酸（GABA）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。在成熟神經(jīng)元，GABA與其A型受體（GABAA受體）結(jié)合后，開放氯離子通道，使氯離子內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)超極化，從而產(chǎn)生中樞抑制作用。GABAA受體主要存在于中樞的抑制性中間神經(jīng)元上，而這種中間神經(jīng)元在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)分布廣泛。海馬的Schaffer-CA1突觸傳遞通路是單突觸谷氨酸能神經(jīng)傳導(dǎo)通路，能夠被抑制性中間神經(jīng)元折返抑制。丙泊酚的麻醉作用位點(diǎn)主要是中樞的GABAA受體[2]。丙泊酚主要是通過突觸前的GABAA受體或離子通道抑制谷氨酸的釋放而影響中樞興奮性。

筆者采用膜片鉗技術(shù)，在大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞上記錄電刺激Schaffer纖維激發(fā)的EPSC，從細(xì)胞水平上研究丙泊酚對(duì)突觸傳遞的影響。本文結(jié)果顯示，在3周齡大鼠，10 μmol/L的丙泊酚對(duì)EPSC有輕微的興奮作用，但更低劑量的丙泊酚對(duì)EPSC沒有影響（結(jié)果未顯示）。這一現(xiàn)象發(fā)生的機(jī)制目前尚不清楚，可能要?dú)w功于神經(jīng)系統(tǒng)的自穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，因其不是筆者研究的重點(diǎn)，故未進(jìn)行深入研究，但臨床研究表明丙泊酚要發(fā)揮其麻醉作用，血藥濃度必須達(dá)到一定的閾值（1.7～1.8 μg/ml），而其 50%有效濃度為 3.0～3.7 μg/ml[3]。隨著劑量的增大，丙泊酚逐漸顯現(xiàn)出對(duì)EPSC的劑量依賴性抑制作用。用Picrotoxin孵育腦片后丙泊酚的作用完全被拮抗，說明其作用是通過GABA受體發(fā)生的。雖然有研究表明，大劑量的丙泊酚可以直接抑制興奮性谷氨酸受體，如AMPA、NMDA受體[4]，但筆者在實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)此種作用，因?yàn)镻icrotoxin可完全拮抗丙泊酚的抑制作用，這也可能與筆者研究的選材有關(guān)系。前人的實(shí)驗(yàn)是在單細(xì)胞上進(jìn)行的，反映的是單一的受體和通道，而筆者實(shí)驗(yàn)是在海馬腦片上進(jìn)行的，反映的是整體水平的突觸效應(yīng)。在臨床麻醉中，丙泊酚的血清有效濃度為8～180 μmol/L[5]。本文實(shí)驗(yàn)中丙泊酚的50%有效量在100 μmol/L左右，與臨床麻醉相符。

LTD是持久的、活動(dòng)依賴性的突觸傳遞效能的降低，是記憶貯存機(jī)制LTP的補(bǔ)充，是學(xué)習(xí)與記憶的理論基礎(chǔ)之一。丙泊酚可以削弱大鼠海馬CA1區(qū)LTP的誘導(dǎo)[6]，但對(duì)LTD的影響尚不清楚。

本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在大鼠海馬CA1區(qū)全細(xì)胞記錄中對(duì)照組低頻可誘導(dǎo)出確切的LTD，而在丙泊酚組，LTD的表達(dá)增強(qiáng)，組間比較差異顯著，這與以往的活體實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。丙泊酚易化LTD的誘導(dǎo)作用可被NMDA受體拮抗劑AP-5阻斷，說明這種LTD是NMDA受體依賴性的，而NMDA受體依賴性正是經(jīng)典突觸可塑性的特點(diǎn)之一。丙泊酚易化LTD誘導(dǎo)的機(jī)制，可能是丙泊酚激活GABAA受體，增強(qiáng)了中樞抑制，同時(shí)反復(fù)的刺激傳入（低頻）可誘發(fā)循環(huán)性抑制。而GABA受體拮抗劑Picrotoxin可抑制LTD的誘導(dǎo)而不影響LTD的維持，也說明LTD的易化是由于中樞抑制作用的增強(qiáng)。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，在嚙齒類動(dòng)物給予鎮(zhèn)靜劑量的丙泊酚只產(chǎn)生順行性遺忘，遺忘程度隨劑量的增加而增強(qiáng)，這有助于消除手術(shù)中的不良記憶。當(dāng)丙泊酚劑量增加到一定程度時(shí)[7]，則可明顯影響動(dòng)物的學(xué)習(xí)和記憶過程，小鼠訓(xùn)練后30 min給予丙泊酚，則小鼠剛建立的被動(dòng)逃避的條件反射難以長期保持，即發(fā)生了逆行性遺忘。這說明訓(xùn)練后產(chǎn)生的瞬間記憶痕不牢固，易發(fā)生變化，隨著時(shí)間的延長而發(fā)生了遺忘。逆行性遺忘僅發(fā)生在訓(xùn)練后3 h內(nèi)給予麻醉藥物，3 h后注射藥物則記憶不受影響。這表明小鼠學(xué)習(xí)訓(xùn)練3 h后進(jìn)行麻醉，訓(xùn)練所獲得的條件反射的短期記憶可進(jìn)入長期記憶階段。因此推測丙泊酚可能影響短期記憶至長期記憶的存儲(chǔ)過程。這種作用可能與激活GABA能神經(jīng)系統(tǒng)的功能密切相關(guān)，因?yàn)镚ABAA受體對(duì)記憶鞏固過程有下調(diào)作用[8]。

有臨床研究報(bào)道，丙泊酚麻醉的患者，術(shù)后常有不同程度認(rèn)知功能障礙等表現(xiàn)，如順行及逆行遺忘等[9]，而且蘇醒后數(shù)小時(shí)內(nèi)難于完成諸如駕車等精細(xì)工作，在兒科麻醉和鎮(zhèn)靜中也發(fā)現(xiàn)丙泊酚可影響患者的認(rèn)知功能，這些都說明了丙泊酚麻醉可能影響了患者的記憶功能。經(jīng)丙泊酚麻醉的患者術(shù)中知曉的發(fā)生率較低，系因?yàn)槠淇僧a(chǎn)生順行性遺忘及逆行性遺忘，有利于消除術(shù)中的惡性記憶。

[1]Sanou J，Ilboudo D，Goodall G，et al.Evaluation of cognitive functions after anesthesia with Propofol.Ann Fr Anesth Reanim，1996，15(8):1155-1161.

[2]Orser BA，Wang LY，Pennefather PS，et al.Propofol modulates activation and desensitization of GABAA receptors in cultured murine hippocampal neurons.J Neurosci，1994，14(12):7747-7760.

[3]Rigouzzo A，Girault L，Louvet N，et al.The relationship between bispectral index and Propofol during target-controlled infusion anesthesia:a comparative study between children and young adults.Anesth Analg，2008，106(4):1109-1116.

[4]Xu AJ，Duan SM，Zeng YM.Effects of intrathecal NMDA and AMPA receptors agonists or antagonists on antinociception of propofol.Acta Pharmacol Sin，2004，25(1):9-14.

[5]Kazama T，Ikeda K，Morita K.The pharmacodynamic interaction between Propofol and Fentanyl with respect to the suppression of somatic or hemodynamic responses to skin incision，peritoneum incision，and abdominal wall retraction.Anesthesiology，1998，89(4):894-906.

[6]Takamatsu I，Sekiguchi M，Wada K，et al.Propofol-mediated impairment of CA1 long-term potentiation in mouse hippocampal slices.Neurosci Lett，2005，389(3):129-132.

[7]Costela JL，Carlos R，Zamacona MK，et al.Interaction between Propofol and Sulfisoxazole in mice an in vivo and in vitro study.Res Commun Mol Pathol Pharmacol，1996，93(1):89-100.

[8]Concas A，Santoro G，Mascia MP，et al.The general anesthetic Propofol enhances the function of γ-aminobutyric acid-coupled chloride channel in the rat cerebral cortex.J Neurochem，1990，55(6):2135-2136.

[9]Rich JB，Yaster M，Brandt J.Anterograde and retrograde memory in children anesthetized with propofol.J Clin Exp Neuropsychol，1999，21(4):535-546.