冰凍切片技術(shù)聯(lián)合免疫組織化學(xué)在胸腹水細(xì)胞診斷中的應(yīng)用研究

蔡暉滔

胸腹水是臨床上多種疾病，特別是腫瘤性疾病的常見伴發(fā)體征，臨床上胸腹水的性質(zhì)對于疾病的診斷有較大的價值，常將胸腹水送病理檢查。一般病理檢查通常離心、涂片、HE染色進(jìn)行病理診斷，但由于細(xì)胞分散、染色效果不好、重復(fù)性差等原因，診斷的陽性率較低，易漏診。尤其是增生的間皮細(xì)胞和轉(zhuǎn)移性腺癌；未分化癌與小細(xì)胞癌和淋巴瘤之間不易區(qū)別，疑診病例較多，對臨床幫助不太大[1]。我們將胸腹水離心進(jìn)行冰凍切片常規(guī)HE染色，同時進(jìn)行相應(yīng)免疫組織化學(xué)標(biāo)記，明顯提高了胸腹水細(xì)胞診斷的陽性率及準(zhǔn)確性。該方法可重復(fù)性高，細(xì)胞清晰，能明確診斷，部分病例能明確腫瘤的類別和來源，有重要的臨床應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

我們從2006年5月至2007年12月共收集我院胸腹水標(biāo)本64例，其中胸水44例、腹水20例，男性38例、女性36例，年齡35～86歲，平均年齡52歲。

1.2 方法

1.2.1 將送檢的胸腹水直接用一次性吸管吸取下面沉淀的部分30mL于試管內(nèi)、離心10min，2500r/min。將上清液去掉，離心沉淀物涂片1張、HE染色。沉淀的部分放在冰凍切片機(jī)的冷凍頭上，然后加人OCT包埋劑進(jìn)行切片。

1.2.2 胸腹水離心沉淀物少就直接倒去上清液，先在冰凍切片機(jī)的冷凍頭上加人OCT包埋劑，然后將胸腹水離心沉淀物放在上面進(jìn)行切片。

1.2.3 胸腹水離心沉淀物常規(guī)切片6張：1張HE染色、5張免疫組織化學(xué)染色。

1.2.4 制作免疫組織化學(xué)染色的冰凍切片必在冷藏保存，然后根據(jù)需要進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色

免疫組織化學(xué)我們標(biāo)記的CK、EMA、LCA、間皮細(xì)胞、Vimentine。免疫組織化學(xué)染色方法：采用即用型快捷免疫組織化學(xué)MaxvislonTm試劑盒，試劑及抗體和免疫組織化學(xué)陽性片由福建邁新生物技術(shù)公司提供，陰性對照采用PBS作為一抗。

其染色步驟如下：①切片實(shí)溫干燥后，入4℃丙酮固定10min，用PBS（pH：7.4）沖洗3次，每次3min（3×3）。②根據(jù)每一種抗體的要求，對組織抗原進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù)，除細(xì)胞角蛋白用胰酶消化外，間皮細(xì)胞、Vimentin、LCA、EMA都要檸檬酸高溫修復(fù)（按說明操作）。③每張切片加1滴3%過氧化氫，室溫下孵育10minPBS洗（3×3）。④每張切片加1滴自選1抗體，室溫下孵育60min。⑤PBS沖洗3×3，除去PBS液每張切片加1滴即用型試劑，室溫下孵育10分鐘，PBS洗3×3。⑥除去PBS液，每張切片加2滴新配制的DAB溶液10min。⑦自來水洗，蘇木素復(fù)染直致中性樹膠封固。

2 結(jié) 果

送檢的64例胸腹水直接離心涂片HE染色診斷陽性細(xì)胞7例，陰性40例，可疑陽性18例。應(yīng)用冰凍切片技術(shù)聯(lián)合免疫組織化學(xué)檢查結(jié)果陽性細(xì)胞24例，陰性38例?？梢申栃詢H2例，見表1和表2。

表1 64例胸腹水單純涂片與冰凍切片HE片診斷結(jié)果

表2 64例胸腹水冰凍切片切片免疫組織化學(xué)標(biāo)記結(jié)果

3 討 論

胸腹水是臨床上多種疾病的首發(fā)體征，正確診斷明確胸腹水性質(zhì)對正確治療有重要意義。臨床上常將送檢的胸腹水單純離心涂片HE染色光鏡下病理診斷，但由于細(xì)胞分散、染色效果不理想，又因細(xì)胞容易堆積成團(tuán)，難以明顯診斷，其診斷的陽性率較低，特別是小細(xì)胞腫瘤難以和間皮瘤、淋巴瘤、未分化腫瘤細(xì)胞之間難以區(qū)別，給診斷帶來困難。我們采用冰凍切片技術(shù)聯(lián)合免疫組織化學(xué)在胸腹水細(xì)胞診斷中的應(yīng)用，明顯提高了陽性細(xì)胞的檢出率，由于冰凍切片技術(shù)是將胸腹水離心、加入OCT后常規(guī)冰凍切片、HE染色，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清楚、重復(fù)性好，還可作免疫組織化學(xué)標(biāo)記、大大提高了胸腹水細(xì)胞診斷的準(zhǔn)確性，免疫組織化學(xué)標(biāo)記又能準(zhǔn)確的定位腫瘤細(xì)胞的表達(dá)的抗原，確定腫瘤細(xì)胞屬性及來源，特別是對分化差的腫瘤的病理診斷或腫瘤類型的確定中起到重要的鑒別作用，在難病例中診斷中，對明確腫瘤類型起著重要的指導(dǎo)意義。不僅有助于良、惡性的判斷而且對常規(guī)涂片中難以鑒別的間皮細(xì)胞和轉(zhuǎn)移性腺癌的識別有重要的參考作用[2]。

同時免疫組織化學(xué)在鑒別間皮細(xì)胞和轉(zhuǎn)移腺癌時，因?yàn)殚g皮細(xì)胞具有雙向分化的特點(diǎn)，因此上皮性抗原不標(biāo)記（EMA）但間葉性標(biāo)記vimentin有不同程度的陽性，而癌細(xì)胞則呈單一性上皮抗原陽性，vimentin常為陰性。間皮細(xì)胞：主要分布在間皮細(xì)胞中，其他腺上皮一般不表達(dá)，主要用于惡性間皮瘤的的診斷，在鑒別診斷時，惡性間皮瘤的陽性部位應(yīng)為細(xì)胞膜，而其他腺癌多為胞漿陽性，在觀察時應(yīng)注意，Vimentin：作為一個陽性對照是很好的標(biāo)記物，在非腫瘤性上皮組織中很容易表達(dá)作為內(nèi)對照。EMA：上皮膜抗原對內(nèi)臟腺上皮的表達(dá)優(yōu)于細(xì)胞角蛋白，因此，對上皮源性腫瘤，尤其是低分化癌最好細(xì)胞易角蛋白聯(lián)合應(yīng)用。CK：細(xì)胞角蛋白用于鱗癌、腺癌、小細(xì)胞癌、惡性間皮瘤部分滑膜肉瘤，平滑肌肉瘤，可疑陽性抗原，在鑒別診斷中EMA進(jìn)行上皮性腫瘤與非上皮性腫瘤的鑒別。LCA主要用于淋巴瘤與未分化小細(xì)胞癌的鑒別[3]。因此，冰凍切片技術(shù)及免疫組織化學(xué)聯(lián)合檢測胸腹水細(xì)胞有重要的應(yīng)用價值。

但在操作中值得注意的幾個問題：①冰凍切片不能太厚，一般4μm連續(xù)切片，同時應(yīng)使用粘膠片，切片后如果不染色，必須吹干，冷藏保存。②在胸腹水細(xì)胞離心沉淀少的情況下，倒去上清應(yīng)該先在冷凍頭上放OCT然后再將胸腹水細(xì)胞離心沉淀物放在上面切片。③如果血性胸腹水，可加入0.5%氯化氨溶液離心去除紅細(xì)胞效果比較好。④在采集胸腹水時最好使用一次性吸管吸取下面沉淀部分，胸腹水應(yīng)新鮮。⑤免疫組織化學(xué)觀察時應(yīng)注意，胞漿和細(xì)胞核陽性的差異，特別是惡性間皮瘤陽性部位在胞膜部分，免疫組織化學(xué)還可根據(jù)病例不同選擇相宜的抗體。

[1]劉夢海,梁忠泉,袁昌隆,等.痰液和胸腹水沉積物切片在腫瘤脫落細(xì)胞中的應(yīng)用[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2003,19(4):409.

[2]丁華新,何向蕾,陳培輝.免疫細(xì)胞化學(xué)在胸腹水細(xì)胞學(xué)鑒別診斷中的應(yīng)用[J].臨床病理學(xué)雜志,2002,99 (4) :220 .

[3]羅慶豐,謝梅,高玟,等.冰凍切片及免疫組織化學(xué)技術(shù)在胸腹水細(xì)胞診斷中的應(yīng)用[J].實(shí)用癌癥雜志,2007,22(4):363.