宮長(zhǎng)榮，程 龍，宋朝鵬，王松鋒

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州 450002；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101）

煙草在生長(zhǎng)過(guò)程中，有大量的次生代謝產(chǎn)物從根系和葉片排出或滲出體外，這些代謝產(chǎn)物為各種微生物的生長(zhǎng)提供了充足的營(yíng)養(yǎng)，在成熟采收的煙葉表面和體內(nèi)形成特殊的微環(huán)境并存在著大量的微生物。微生物在縮短發(fā)酵時(shí)間、調(diào)控?zé)熑~有害成分（如煙堿、蛋白質(zhì)、TSNA等）、增進(jìn)煙葉香氣等方面對(duì)煙葉品質(zhì)改善中發(fā)揮著重要作用[1]。煙葉調(diào)制加工所需時(shí)間較短，此期間微生物的活動(dòng)及其對(duì)煙葉品質(zhì)的影響也較少受到關(guān)注，對(duì)它們的研究報(bào)道較少。國(guó)外有研究表明，某些微生物在烘烤過(guò)程中對(duì)煙葉的腐爛和煙葉有害成分含量的消長(zhǎng)等方面有重要影響[2-4]。

不同部位煙葉在不同烘烤時(shí)期的優(yōu)勢(shì)菌屬為最適宜當(dāng)時(shí)營(yíng)養(yǎng)條件的菌類，生命活動(dòng)能力比同期的其他菌屬高。它們的自養(yǎng)異養(yǎng)所產(chǎn)生的生理生化作用對(duì)煙葉品質(zhì)造成一定影響。本試驗(yàn)通過(guò)研究河南汝陽(yáng)上、中、下三部位煙葉在烘烤過(guò)程中微生物的數(shù)量及優(yōu)勢(shì)種類的變化，探討煙葉烘烤過(guò)程優(yōu)勢(shì)微生物資源的可用性，為篩選和開(kāi)發(fā)有利于烘烤過(guò)程提高煙葉品質(zhì)的微生物種群提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)于2008年7—10月進(jìn)行，試驗(yàn)材料取自于河南汝陽(yáng)縣。供試烤煙品種為新 NC89，5月 5日移栽，種植行距120 cm，株距50 cm，田間管理按優(yōu)質(zhì)烤煙栽培生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣品制備

取生長(zhǎng)發(fā)育正常、成熟采收煙葉。采用河南農(nóng)業(yè)大學(xué)設(shè)計(jì)的電熱式溫濕自控密集烤煙箱進(jìn)行常規(guī)烘烤。分別于開(kāi)始烘烤以前及開(kāi)始后取4次樣。即：鮮煙樣（成熟采收后烘烤前）；38℃（干球溫度38℃結(jié)束時(shí)，葉片八成黃）；42℃（干球溫度42℃結(jié)束時(shí)，葉片全黃）；48℃（干球溫度 48℃結(jié)束時(shí)，葉片葉筋全黃）。

1.3 微生物的分離及培養(yǎng)

每次隨即剪取煙樣 100 g，使用高壓滅菌后的研缽研碎，加無(wú)菌水定容到100 mL三角瓶，按常規(guī)稀釋平板涂抹法進(jìn)行微生物的分離和計(jì)數(shù)，稀釋倍數(shù)選取 10-2，10-3，10-4，10-5。分離真菌用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、H2O 1 000 mL），使用前加入10%的卡那霉素溶液1 mL/L；分離細(xì)菌選取牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、H2O 1 000 mL、pH 7.0）。每次3個(gè)重復(fù)。取每次煙樣微生物分離中的最優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行鑒定。

1.4 微生物的鑒定

真菌主要依據(jù)真菌鑒定手冊(cè)、真菌學(xué)及植物病原真菌學(xué)檢索表，進(jìn)行鑒定。常見(jiàn)的典型真菌，依據(jù)菌絲分枝和孢子形態(tài)直接鑒定到屬，對(duì)于不產(chǎn)孢子的真菌，誘導(dǎo)其產(chǎn)生孢子后鑒定。參閱相關(guān)文獻(xiàn)[5-6]鑒定到屬。細(xì)菌采用KOH法，革蘭氏染色法，常規(guī)菌體形態(tài)觀察[7-8]后，使用法國(guó)梅里埃公司的VIEK32全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)，選用快速陽(yáng)性鑒定卡GNI+（V1316）和快速陰性鑒定卡GPI（V1315）鑒定到屬。

2 結(jié) 果

2.1 烘烤過(guò)程真菌的變化

從表1可以看出，鮮煙樣中，煙葉所含真菌數(shù)最少的是下部葉，為 0.65×105cfu/g，上部葉真菌量最多，為 0.79×105cfu/g。烘烤開(kāi)始后，不同部位煙葉真菌含量均呈先下降后上升變化。這可能是由于烘烤從開(kāi)始至干球38℃煙葉達(dá)到八成黃期間，烤箱內(nèi)的溫度低、濕度高，比較適宜細(xì)菌生長(zhǎng)，煙葉含真菌量緩慢下降。干球38℃后，隨著烤房溫度上升濕度下降，不同部位煙葉的真菌量均緩慢上升，在干球42℃煙葉達(dá)到葉片全黃時(shí)達(dá)到最高。此時(shí)，中部葉真菌量最高，為1.12×105cfu/g，下部葉次之，為 1.07×105cfu/g。隨后，烤房溫度繼續(xù)上升濕度繼續(xù)下降，不同部位煙葉真菌含量呈下降趨勢(shì)。

表1 烘烤過(guò)程不同部位煙葉微生物的含量Table1 Amount of microorganism on flue-cured tobacco leaves during curing process

2.2 烘烤過(guò)程細(xì)菌的變化

不同部位煙葉在烘烤過(guò)程中各時(shí)期細(xì)菌總量變化情況見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，不同部位的鮮煙葉，下部葉細(xì)菌量最多，為2.3×105cfu/g；上部葉細(xì)菌量最少為1.01×105cfu/g，這可能是由于上部葉受到陽(yáng)光直射，下部葉接近地面且濕度較高更適宜細(xì)菌繁殖。烘烤過(guò)程開(kāi)始時(shí)不同部位煙葉的細(xì)菌量均逐漸增多，到干球溫度38℃時(shí)不同部位煙葉細(xì)菌量均達(dá)到最大，中部葉含細(xì)菌量由鮮煙葉的1.63×105cfu/g升至 3.91×105cfu/g，高于此時(shí)期下部葉的2.83×105cfu/g和上部葉的2.98×105cfu/g。干球溫度38℃至42℃間不同部位煙葉細(xì)菌含量略微下降，其后隨煙葉的大量脫水干燥，細(xì)菌數(shù)量明顯下降。到48℃葉片葉筋全黃時(shí)期，煙葉細(xì)菌量已低于鮮煙葉時(shí)細(xì)菌量的1～2倍。

2.3 烘烤過(guò)程微生物優(yōu)勢(shì)菌屬的變化

不同部位不同烘烤時(shí)期優(yōu)勢(shì)菌屬鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。共分離出不同的真菌優(yōu)勢(shì)屬5種，經(jīng)鑒定分別屬于枝孢霉屬(Cladosporium)、青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)、鏈格孢屬(Alternaria)、鐮刀菌屬(Fusarium)。其中各時(shí)期煙樣優(yōu)勢(shì)真菌中出現(xiàn)次數(shù)最多的優(yōu)勢(shì)類群為青霉菌和曲霉菌，其次為枝孢霉菌和鏈格孢菌。共分離鑒定出不同的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬11種，分別為檸檬酸桿菌屬 (Citrobacter)，曼氏桿菌屬（Mannheimia)，棒桿菌屬(Corynebacterium)，芽孢桿菌屬(Bacillus)，腸桿菌屬(Enterobacter)，節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)，不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter），巴斯德氏菌屬 (Pasteurella)，泛菌屬(Pantoea)，鞘氨醇單胞菌屬 (Sphingomonas)，假單胞菌屬(Pseudomonas)。

表2 煙葉烘烤過(guò)程中微生物優(yōu)勢(shì)菌群的變化Table2 Changes of dominant microorganism during the flue-curing process of tobacco leaves

3 討 論

下、中、上三個(gè)部位的烤煙煙葉在烘烤過(guò)程中，煙葉細(xì)菌最高含量出現(xiàn)在中部葉 38℃八成黃時(shí)期的2.98×105cfu/g。這比張樹(shù)堂等人研究的最高細(xì)菌含量少，原因可能是烤煙烘烤設(shè)備、細(xì)菌分離培養(yǎng)方法的不同。烘烤過(guò)程細(xì)菌含量變化規(guī)律與Morin研究基本一致[9-10]。鮮煙葉中出現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，如檸檬酸桿菌屬、曼氏桿菌屬，是腸道中通常的棲居菌，常見(jiàn)于水、食物、糞便中，可以推斷鮮煙葉葉圍微生物的優(yōu)勢(shì)菌種類與煙葉生長(zhǎng)部位、當(dāng)?shù)厣a(chǎn)環(huán)境及管理有一定關(guān)系。3個(gè)不同部位煙葉烘烤過(guò)程中葉圍優(yōu)勢(shì)微生物的種類不完全相同，這可能與烤前不同部位鮮煙葉帶菌種類不相同有關(guān)。烘烤過(guò)程分離的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌證明，棒桿菌屬、腸桿菌屬、芽孢桿菌屬、泛菌屬在干球48℃前適宜烤房?jī)?nèi)環(huán)境并能較好的進(jìn)行自養(yǎng)或異養(yǎng)活動(dòng)。它們的自養(yǎng)異樣所產(chǎn)生的生理生化作用可能對(duì)煙葉品質(zhì)的影響強(qiáng)于其他菌屬。

煙草調(diào)制是煙葉采收后的一個(gè)重要加工環(huán)節(jié)，其可控性非常強(qiáng)，對(duì)利用微生物改進(jìn)提高煙葉品質(zhì)非常有利。微生物資源豐富，代謝功能復(fù)雜，而且易于培養(yǎng)再生，因此，篩選開(kāi)發(fā)利用對(duì)煙草品質(zhì)有利的微生物具有非常大的前景。本試驗(yàn)分離到的微生物，僅僅是煙葉葉片組織中能在供試培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株，要明確烘烤過(guò)程煙葉葉片組織所有微生物的種類，還有待于進(jìn)一步的工作并嘗試其它分離、培養(yǎng)和鑒定方法。如采用更多種類的培養(yǎng)基、厭氧條件培養(yǎng)或分子生物學(xué)鑒定方法等。已鑒定的各種微生物對(duì)在烘烤過(guò)程中煙葉品質(zhì)的影響作用也有待于進(jìn)一步研究。

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