譚佩毅 蔡 香 丁 凱 徐學(xué)文 許平平 趙 婷

淮安地區(qū)水產(chǎn)資源豐富，特別是近年來隨著人工養(yǎng)殖技術(shù)的發(fā)展，蝦、蟹產(chǎn)量逐年遞增，僅龍蝦（螯蝦）的年產(chǎn)量已經(jīng)超過10萬噸，而龍蝦的殼大多是作為廢物或垃圾處理，若能充分利用這些廢棄物，從中提取殼聚糖，能夠合理利用資源，提升水產(chǎn)品的附加值，在取得良好經(jīng)濟(jì)效益的同時，還能減輕這些廢棄物對環(huán)境造成的壓力，有效地變廢為寶，保護(hù)環(huán)境。

殼聚糖具有抗菌、降脂等作用，并可促進(jìn)動物免疫機(jī)能、改善腸道微生態(tài)環(huán)境，因此有望成為家畜飼用抗生素的替代品。利用殼聚糖開發(fā)綠色新型飼料添加劑，對于充分利用地方資源優(yōu)勢，促進(jìn)區(qū)域經(jīng)濟(jì)與環(huán)境協(xié)調(diào)發(fā)展，具有重要的現(xiàn)實意義。本試驗在探討龍蝦殼聚糖的制備條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，研究了殼聚糖對斷奶仔豬生長和免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

蝦殼，江蘇天龍農(nóng)牧科技發(fā)展有限公司提供；鹽酸、氫氧化鈉均為國產(chǎn)試劑純；原子吸收分光光度計，烏氏粘度計等。

1.2 試驗方法

1.2.1 殼聚糖的制備方法

稱取100 g干凈無雜質(zhì)的蝦殼，用1 000 ml濃度為5%的稀鹽酸浸泡24 h。浸泡開始階段反應(yīng)劇烈，產(chǎn)氣迅速，應(yīng)不時攪拌，以免酸液和蝦殼溢出容器。浸泡到一定時間后隨時用pH試紙檢測酸液的pH值，當(dāng)接近中性時，續(xù)入新配酸液以保證脫鈣反應(yīng)進(jìn)行徹底。脫鈣后的甲殼經(jīng)過水洗后，在濃度為5%的NaOH稀溶液中煮沸4 h，以除去其中的蛋白質(zhì)。脫蛋白后的濾渣經(jīng)過充分水洗干燥，得到甲殼素。

取一定量的甲殼素，按20 g/l的比例浸泡于濃NaOH溶液中，保溫一定時間進(jìn)行脫乙酰反應(yīng)，其間不時用玻璃棒攪拌反應(yīng)體系，以保證反應(yīng)充分進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，過濾，將濾渣用水洗至中性，干燥得到殼聚糖。

1.2.2 殼聚糖制備條件優(yōu)化

1.2.2.1 處理溫度的篩選

在45%堿濃度和處理時間2 h的條件下，設(shè)定8個不同的處理溫度（60、70、80、90、100、110、120、130℃），每個處理溫度各做6個重復(fù)，篩選有利于提高殼聚糖脫乙酰度的適宜處理溫度。

1.2.2.2 處理時間的篩選

在45%堿濃度及已經(jīng)篩選的適宜溫度（110℃）下，設(shè)定 6 個不同的處理時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h），每個處理時間各做6個重復(fù)，篩選有利于提高殼聚糖脫乙酰度的適宜處理時間。

1.2.2.3 堿濃度的篩選

在已經(jīng)篩選的適宜溫度（110℃）和處理時間（1.5 h）下，設(shè)定6個不同的NaOH濃度（35%、40%、45%、50%、55%、60%），每個堿濃度各做6個重復(fù)，有利于提高殼聚糖脫乙酰度的適宜堿濃度。

1.2.3 殼聚糖脫乙酰度的測定

參考蔣挺大（2001）介紹的方法，采用酸堿滴定法測定。

1.2.4 動物試驗方法

試驗隨機(jī)選取28日齡斷奶仔豬48頭，初始體重為（7.31±0.89）kg，按體重均等、遺傳相近的原則分為對照組（基礎(chǔ)日糧）和試驗組（基礎(chǔ)日糧添加500mg/kg的殼聚糖），每組6個重復(fù)，每個重復(fù)4頭豬。常規(guī)管理，自由采食和飲水。試驗日糧營養(yǎng)水平按照NRC（1998）配制（見表1）。

表1 日糧配方和營養(yǎng)水平

試驗全期21 d，試驗開始時測定初始體重，第14、21 d時進(jìn)行稱重、結(jié)料，統(tǒng)計平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和飼料轉(zhuǎn)化率（FCR）等指標(biāo)；于21 d對該豬采血測定淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率及血清溶血素含量。

1.2.5 免疫指標(biāo)測定方法

1.2.5.1 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率

從仔豬前腔靜脈用肝素抗凝真空管采血4 ml，取10 ml離心管加淋巴細(xì)胞分層液6 ml，然后沿管壁緩緩疊加3 ml血，2 500 r/min離心30 min，取中間白細(xì)胞部分，用 3～5倍體積 RPMI-1640洗 3次，每次2 000 r/min離心10 min。然后將細(xì)胞懸浮于RPMI-1640完全培養(yǎng)液，用臺盼藍(lán)染色計數(shù)活細(xì)胞數(shù)（＞95%），調(diào)整細(xì)胞濃度為 2×106個/ml。

將淋巴細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入Con A（終濃度為5 μg/ml），另一組加入等體積的培養(yǎng)液為對照，培養(yǎng)體系為每孔 200 μl。置 5%CO2、37℃培養(yǎng)72 h。在培養(yǎng)結(jié)束前6 h，每孔加入10 μl MTT（初始濃度為5mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入10%SDS-0.04 M HCl溶液 100 μl，繼續(xù)培養(yǎng) 2 h，使紫色結(jié)晶完全溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀在570 nm波長下測定OD值。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率用刺激指數(shù)（SI）表示，SI=Con A刺激孔OD570nm/對照孔OD570nm。

1.2.5.2 血清溶血素含量

血清用生理鹽水稀釋200倍。取稀釋的血清1 ml于試管中，依次加10%SRBC懸液0.5 ml，1：10稀釋的補體（豚鼠血清）1 ml，搖勻。將試管(反應(yīng)管)置37℃恒溫水浴中保溫10 min，取出后立即將管移入冰浴中，以終止反應(yīng)。將各管于540 nm處以對照管作空白，分別測定各管光密度值(OD值)。

2 試驗結(jié)果

2.1 殼聚糖制備條件優(yōu)化試驗結(jié)果

2.1.1 處理溫度的篩選結(jié)果

由表2可以發(fā)現(xiàn)，處理溫度對龍蝦殼聚糖的脫乙酰度有顯著影響。處理溫度在60～110℃范圍內(nèi)，脫乙酰度隨著溫度的升高而增加（P＜0.05）；超過110℃趨于恒定，不再隨著溫度的升高而有顯著提高，120、130℃與110℃相比，沒有顯著差異性（P＞0.05）。由此可以看出，溫度在110℃以上是制備高脫乙酰度的龍蝦殼聚糖適宜溫度條件。

表2 不同處理溫度對殼聚糖脫乙酰度的影響

2.1.2 處理時間的篩選結(jié)果（見表3）

由表3可以看出，處理時間對殼聚糖脫乙酰度有顯著的影響，隨著處理時間的延長，殼聚糖的脫乙酰度呈一次線性升高（P＜0.05）。其中，1.5、2.0、2.5 和 3.0 h 4個處理組間的脫乙酰度無顯著差異，但均顯著高于0.5 h處理組及1.0 h處理組，1.0 h處理組亦顯著高于0.5 h處理組（P＜0.05）。由此可知，龍蝦殼聚糖制備的處理時間在1.5 h以上為宜。

表3 不同處理時間對殼聚糖脫乙酰度的影響

2.1.3 堿濃度的篩選結(jié)果（見表4）

由表4可以看出，堿濃度的高低顯著影響殼聚糖的脫乙酰度，隨著堿濃度的增加，脫乙酰度顯著升高（P＜0.05）。當(dāng)堿濃度為50%時，殼聚糖的脫乙酰度達(dá)到91.10%，顯著高于35%、40%和45%3個濃度處理組；50%、55%和60%三者之間差異不顯著（P＞0.05）。由此可知，龍蝦殼聚糖制備的處理堿濃度應(yīng)在50%以上。

表4 不同堿濃度對殼聚糖脫乙酰度的影響

2.2 動物試驗結(jié)果

2.2.1 生長性能（見表5）

從表5可知，在0～14 d殼聚糖組的平均日增重和平均日采食量優(yōu)于對照組，但兩組間沒有顯著性差異（P＞0.05）；在14～21 d 以及試驗全期（0～21 d），兩組間日增重和日采食量差異顯著（P＜0.05）；14～21 d以及試驗全期（0～21 d）殼聚糖組的飼料轉(zhuǎn)化率優(yōu)于對照組，但兩組間沒有顯著性差異（P＞0.05），說明在日糧中添加500mg/kg的龍蝦殼聚糖，對斷奶仔豬具有一定的促生長效果，能提高斷奶仔豬日增重和日采食量，改善仔豬生長性能。

表5 日糧中添加殼聚糖對斷奶仔豬生長性能的影響

2.2.2 免疫功能（見表6）

表6 日糧中添加殼聚糖對斷奶仔豬免疫功能的影響

從表6可以發(fā)現(xiàn)，龍蝦殼聚糖能極顯著地提高斷奶仔豬淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率（P＜0.01），顯著地提高斷奶仔豬血清溶血素含量（P＜0.05），改善仔豬的細(xì)胞免疫和體液免疫功能。

3 分析與討論

迄今為止，已有許多資料報道了不同制備條件對殼聚糖脫乙酰度的影響。謝雅明（1983）提出了脫乙酰基的速度與堿液濃度和溫度的關(guān)系：當(dāng)NaOH濃度在30%以下時，不論處理過程中的溫度多高，時間多長，只能脫除甲殼素中半數(shù)的乙?；礆ぞ厶堑拿撘阴６戎荒苓_(dá)到50%；反應(yīng)溫度越高，脫乙?；乃俣仍娇?。堿液濃度為40%時，當(dāng)反應(yīng)溫度保持在135～140℃，1～2 h即可基本脫凈乙?；?；若溫度在50～60℃之間，則需要24 h。朱巖（1997）研究表明，制備高脫乙酰度的殼聚糖可采取兩種方法，一是在溫度較低和處理時間較長的條件下制備，二是在溫度較高和處理時間較短的條件下制備。前者需要的周期過長，后者時間短、產(chǎn)量高。而曹根庭等（1995）研究認(rèn)為，在一定范圍內(nèi)，隨著堿濃度、處理時間或處理溫度的增加，開始時殼聚糖的脫乙酰度升高較快，之后則升高緩慢甚至有所下降。本試驗以龍蝦殼制取的甲殼素為原料，得出了相似的結(jié)果，在溫度110℃以上，堿處理濃度50%、處理時間在1.5 h以上條件下，可制備脫乙酰度90%以上的高脫乙酰度龍蝦殼聚糖。

本試驗還發(fā)現(xiàn)，在日糧中添加500mg/kg的龍蝦殼聚糖，對斷奶仔豬具有一定的促生長效果，能提高斷奶仔豬日增重和日采食量，改善仔豬生長性能，同時提高斷奶仔豬淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率及血清溶血素含量，改善仔豬的細(xì)胞免疫和體液免疫功能。

[1]蔣挺大.殼聚糖[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2001.

[2]謝雅明.可溶性甲殼質(zhì)的制造和用途 [J].化學(xué)世界，1983（4）：118-121.

[3]朱巖.殼聚糖脫乙酰化度的測定及反應(yīng)條件對脫乙?；鹊挠绊慬J].荊門大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），1997,8（1）：1-9.

[4]曹根庭，周濤.高粘度、高脫乙酰度殼聚糖的研制.浙江水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報，1995,14（4）：267-274.

[5]張彩芬,史彬林,馬躍軍,等.殼聚糖對仔豬細(xì)胞免疫和體液免疫機(jī)能的影響[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)(科技版),2009（11）：107-109.