謝建中

附紅細(xì)胞體病是由附紅細(xì)胞體寄生在人或多種動物紅細(xì)胞表面、血漿和骨髓而引起的一種人獸共患病，Doyle首次在印度發(fā)現(xiàn)豬附紅細(xì)胞體并歸入立克次氏體[1],但近年根據(jù)16S rRNA基因序列分析將其歸為支原體屬（Mycoplasma)[2-3],2002年Nemark等[4]將該病原體更名為 Mycoplasma suis（M.suis）,現(xiàn)分類作為支原體屬的單個新種，近年來該病在全國呈暴發(fā)流行趨勢，引起廣大醫(yī)學(xué)和畜牧工作者的注意。

目前臨床上對該病的診斷尤為重視，本研究對鮮血壓片、姬姆薩染色、吖啶橙染色以及PCR法4種診斷方法進(jìn)行臨床比較，以期找到更為科學(xué)準(zhǔn)確的診斷手段。

1 材料和方法

1.1 待測血樣

血樣來源于獸醫(yī)門診具有豬附紅細(xì)胞體病臨床癥狀的疑似病例豬體。

1.2 鮮血壓片和姬姆薩染色

鮮血壓片檢查以血漿中和紅細(xì)胞表面見到多形淡綠色小體為陽性。姬姆薩染色采用改進(jìn)方法，包括血液推片，火焰固定，加溫染色0.5 min，自然染色5 min，以油鏡觀察紅細(xì)胞上出現(xiàn)青紫色小體為陽性。

1.3 吖啶橙染色

具體染色方法是將涂有標(biāo)本的涂片用95%乙醇固定標(biāo)本15～30 min，用濾紙吸去載玻片上的殘液，用1%醋酸酸化30 s，用 PBS清洗 1 min，加 0.01%吖啶橙染液染色1～5 min，用 PBS清洗1 min，加0.1mol/l CaCl2分化30 s～2 min，用PBS清洗3次，每次數(shù)秒，熒光顯微鏡觀察，以紅細(xì)胞邊緣上出現(xiàn)淡綠色熒光為陽性。

1.4 豬附紅細(xì)胞體DNA基因提取

取400 μlACD抗凝血加入1.5 mlEP管中，加入200 μl裂解液（100 mmol Tris,10.0 mmol EDTA,1.0 mol NaCl,pH 值 7.4）,再加入 8 μl蛋白酶 K(20mg/ml)和100 μl 10%SDS溶液56℃水浴3 h。于100℃ 10 min滅活蛋白酶K，加入等體積的苯酚：氯仿：異戊醇（25： 24： 1）抽提兩次，4℃離心15 000 g 10 min。加入等體積的氯仿：異戊醇（24：1）抽提1次，4℃離心15 000 g 10 min。取上清液加入兩倍體積的無水乙醇和1/10體積的2 mol/l的NaAc，-70℃沉淀30 min,4℃離心15 000 g 30 min。用70%的無水乙醇漂洗1次，自然干燥，用30 μl的ddH2O溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 引物設(shè)計與合成

根據(jù)Genbank中的豬附紅細(xì)胞體新基因組序列（AJ504999），利用Primer5.0設(shè)計1對特異性引物：

F1 5'CAGCGGTGAGAAAGCAAG 3'

F2 5'CTGGGTGTATGAAGAGTGGTGT 3'。

引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成，擴(kuò)增的目的片段為603 bp。

1.6 PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序

對樣本DNA用上述引物在TECHNE,TC 512基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。50 μl反應(yīng)體系如下：DNA Taq聚合酶1.25 U，10×PCR Buffer（Mg2+Free）5 μl，dNTP Mixture（各 2.5 mmol/l）4 μl，MgCl2（25 mmol/l）2.5 μl，模板 DNA 2 μl，引物（20 μmol/l）各 1 μl，加滅菌蒸餾水至50 μl。反應(yīng)程序如下：預(yù)變性95℃5 min；（變性94℃ 50 s，退火56℃ 50 s，延伸 72℃ 50 s）×35個循環(huán)；終末延伸72℃10 min。

1.7 特異性試驗

用F1和F2為引物，以多殺性巴氏桿菌、豬鏈球菌、弓形蟲、牛巴貝斯蟲、豬圓環(huán)病毒的基因組、血液基因組DNA作為特異性試驗的模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.8 敏感性試驗

提取豬附紅細(xì)胞體血液基因組DNA，測定其OD260nm值，并進(jìn)行10倍稀釋，用F1和F2為引物進(jìn)行擴(kuò)增，確定PCR方法敏感性。

1.9 臨床樣本檢測試驗

對臨床20例疑似病例分別利用鮮血壓片、姬姆薩染色、吖啶橙染液染色和PCR方法檢測，確定陽性檢出率。

2 結(jié)果

2.1 PCR特異性反應(yīng)試驗結(jié)果（見圖1）

圖1 特異性試驗結(jié)果

結(jié)果表明，只有豬附紅細(xì)胞體擴(kuò)增出特異性條帶，其他病原體未見條帶。

2.2 PCR反應(yīng)敏感性試驗結(jié)果

試驗結(jié)果表明，能檢測到的血液基因組DNA最高敏感度為0.65 ng。

2.3 20例臨床樣品的檢測結(jié)果（見圖2）

鮮血壓片、姬姆薩染色、吖啶橙染色及PCR檢出率分別為20%、35%、50%、70%，PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖2。

圖2 臨床樣品檢測結(jié)果

3 討論

從試驗檢測結(jié)果可以看出，PCR方法(70%)）的檢出率最高，而吖啶橙染色（50%）、姬姆薩染色（35%）和鮮血壓片（20%）的陽性檢出率較低，有力的證實了PCR方法比其他診斷方法在檢測豬附紅細(xì)胞體方面更加科學(xué)準(zhǔn)確。

本試驗研究表明，從臨床癥狀疑似的病例PCR診斷結(jié)果并不一定是豬附紅細(xì)胞體病，因此，憑借臨床癥狀診斷存在較大缺陷，另外光鏡檢查存在假陽性率較高，許多原因造成紅細(xì)胞變形，如染色劑附著在紅細(xì)胞上，貧血會造成棘形、鋸齒形紅細(xì)胞增多，尤其當(dāng)紅細(xì)胞表面附紅細(xì)胞體數(shù)量少，或由于貧血等原因而導(dǎo)致血片中有大量的變形紅細(xì)胞和紅細(xì)胞碎片時，很難與紅細(xì)胞中出現(xiàn)的一些嗜堿性物質(zhì)，如帕彭海姆體(Pappenheimer bodies)、海因茨體(Heinz bodies)和豪厄爾一若利小體(Howell-Jolly bodies)相區(qū)別[5]，影響了檢測結(jié)果，PCR技術(shù)具有快速、靈敏、特異性強等一系列優(yōu)點，它能大量擴(kuò)增低拷貝甚至單拷貝基因序列，很容易被瓊脂糖凝膠電泳檢測[6]，許多輕微差別的疾病診斷也可通過PCR方法在短時間內(nèi)得到結(jié)論，本試驗基于血液基因組設(shè)計引物建立的PCR診斷方法有較高診斷特異性，DNA最低檢測量為0.65 ng，同時可以和其他相關(guān)的豬病原體進(jìn)行區(qū)別診斷，保證了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，憑借PCR診斷方法的自身優(yōu)勢可以成為臨床診斷豬附紅細(xì)胞體病的一種必要手段，值得在臨床上推廣應(yīng)用。

[1]Doyle L P.A rickettsia-like or anaplasmosis-like disease in swine[J].J.Am.Vet.Med.Ass.,1932（8）:668-671.

[2]Neimark H,Johansson K E,Rikihisa Y,et al.Proposal to transfer some members of the genera Haemobartonella and Eperythrozoon to the genus Mycoplasma with descriptions of'Candidatus Mycoplasma haemofelis','Candidatus Mycoplasma haemomuris''Candidatus Mycoplasma haemosuis'and'Candidatus Mycoplasma wenyonii'[J].Int.J.Syst.Evol.Microbiol.,2001,51(3):891-899.

[3]Messick JB,WalkerP G,RaphaelW,etal.'Candidatus Mycoplasma haemodidelphidis′sp.nov., 'Can- didatus Mycoplasma haemolamae′sp.nov.and Mycop lasma haemocanis comb.nov.,haemotrophic parasites from a naturally infected opossum (Didelphis virginiana),alpaca (Lama pacos)and dog(Canis familiaris) : phylogenetic and secondary structural relatedness of their 16S rRNA gene to other mycoplasmas[J].Int.J.Syst.Evol.Microbiol.,2002,52:693-698.

[4]Neimark H,K.E.Johansson,Y.Rikihisa,et al.Revision of haemotrophic Mycoplasma species names[J].Int.J.Syst.Evol.Microbiol.,2002,52:683.

[5]Messiek J B,Smith G,Berent L,et al.Genome size of Eperythrozoon suis and Hybridization with 16S rRNA gene[J].Can.J.M.icrobiol.,2000,46:1082-1086.

[6]Hoelzle L E,Adelt D,Hoelzle K,et al.Development of a diagnostic PCR assay based on novel DNA sequences for the detection of Mycoplasma suis（Eperythrozoon suis)in porcine blood[J].Vet Microbiol.,2003,93(3):185-196.