徐 律 楊金生 丁迎燕 夏松養(yǎng)

魚糜制品是以魚類為原料經(jīng)采肉、漂洗、精濾、脫水、攪拌、成型、加熱等工序加工而成的，營養(yǎng)價(jià)值高，深受消費(fèi)者喜愛。魚糜生產(chǎn)中，為了得到彈性好、色澤白的優(yōu)質(zhì)魚糜，采肉后的碎魚肉一般需進(jìn)行漂洗。漂洗過程中一定量的水溶性蛋白質(zhì)溶于水中，作為廢水而廢棄，十分可惜。魚肉肉質(zhì)鮮嫩美味，其中所含的必需氨基酸齊全，各種氨基酸組成合理，易被人體消化吸收利用，是一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)。從漂洗水中提取的蛋白，可作為蛋白源添加到食品中供人食用，也可以添加到飼料中，供各種動(dòng)物養(yǎng)殖用，用途廣泛。本文通過對(duì)魚糜漂洗水中蛋白質(zhì)的提取方法的研究，為科學(xué)利用廢水魚蛋白提供技術(shù)依據(jù)[1]。

1 實(shí)驗(yàn)材料、主要儀器與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

原料（魚糜漂洗水）：魚糜加工廠取樣。

1.2 主要儀器、試劑

低速大容量離心機(jī)、冷凍離心機(jī)、氮蒸餾裝置、pH計(jì)、冷凍干燥機(jī)、套式恒溫器。三氯化鐵、磷酸、明礬、乙酸。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 測(cè)定方法

水分的測(cè)定[2]按照GB；蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用凱式定氮法；pH計(jì)測(cè)定pH值。

2.2 操作方法

2.2.1 等電點(diǎn)沉淀提取法[3-5]

2.2.1.1 工藝流程

原料→過濾處理（去渣）→調(diào)節(jié)濾液的pH值（用磷酸或乙酸）→pH值的測(cè)定→靜置→去除上清液→干燥→稱重

2.2.1.2 試劑的準(zhǔn)備

將磷酸稀釋到原來濃度的0.1%、0.2%、0.4%，乙酸稀釋到原來濃度的0.2%、1.0%、4.0%，以上6種不同的酸溶液作為pH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)溶液的等電點(diǎn)。

①原料處理

用紗布（一層）對(duì)原液進(jìn)行過濾，除去濾渣（濾渣可回收利用），使濾液看上去無明顯的大顆粒懸浮物。

②濾液pH值的調(diào)節(jié)

準(zhǔn)備 40 支試管，標(biāo)號(hào)為 A1、A2…A19、A20，每支試管均加入 8.0 ml濾液。其中溶液 A1、A2…A9、A10以磷酸為pH調(diào)節(jié)劑，溶液A11、A12…A19、A20是以乙酸為pH調(diào)節(jié)劑。pH調(diào)節(jié)劑加入各試管中后，添加自然水，保證各試管溶液的體積達(dá)到10.0 ml。操作如下：

向 A1～A6分別加入 0.1% 磷酸 0、0.5、0.8、1.2、1.6、2.0 ml；向 A7～A9中分別加入 0.2% 磷酸 1.4、1.6、1.8 ml；向A10中加入0.4%磷酸1.2 ml，各加入濾液8 ml，并加水定容至10 ml。

向 A11～A14分別加入 0.2% 乙酸 0、0.2、1.0、1.8 ml；向 A15～A16中分別加入 1.0%乙酸 0.5、1.0 ml；向 A17～A20中加入 4.0%乙酸 0.8、1.0、1.2、2.0 ml；同時(shí)各加入濾液 8 ml，并加水定容至 10 ml。另取試管 B1、B2…B20，做平行試驗(yàn)，操作同上。

③pH值的測(cè)定

40份溶液配制完后，搖勻，快速用已調(diào)節(jié)好的pH計(jì)測(cè)得各溶液的pH值。

④離心干燥處理

溶液 A1～A20：靜置 90 min，將 20份溶液分別倒入離心管內(nèi)，在4 200 r/min下，離心15 min。除去上清液，在60℃下干燥約10 h，至恒重，稱量。

溶液 B1～B20：靜置 90 min后，產(chǎn)生分層現(xiàn)象，挑選出分層現(xiàn)象明顯的試管，除去上清液，取絮狀沉淀物在干燥皿中稱量，在60℃的干燥箱內(nèi)干燥約10 h，至恒重，稱量。那些無明顯分層現(xiàn)象產(chǎn)生的溶液，提取物質(zhì)量記為0。

2.2.2 添加凝聚劑提取法[6-7]

2.2.2.1 工藝流程

原料→過濾處理（去渣）→添加凝聚劑→靜置觀察現(xiàn)象（混濁度）→去除上清液→干燥→稱量

2.2.2.2 操作要點(diǎn)

①原料處理：用紗布對(duì)原液進(jìn)行過濾，除去濾渣（回收利用），濾液中無明顯的大顆粒懸浮物。

②凝聚劑的添加方法：向試管A21～A30中分別加入 0.1%三氯化鐵 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、2.0 ml，各加入濾液 8.0 ml，用水定容至 10 ml。

向試管 A31～A40中分別加入 0.1%氯化鋁 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、2.0 ml，各加入濾液 8.0 ml，用水定容至10 ml。

向試管 A41～A50中分別加入明礬 0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0mg，各加入濾液定容至 10.0 ml。

③離心干燥：分別把上述溶液搖勻靜置，觀察沉淀情況,當(dāng)溶液有明顯的絮狀沉淀物產(chǎn)生時(shí)（約90 min），取出，去上清液，沉淀物置于干燥皿中，在60℃的烘箱內(nèi)（約10 h）烘至恒重，稱量。那些無明顯分層現(xiàn)象產(chǎn)生的溶液，提取物質(zhì)量記為0。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論

3.1 原料的測(cè)定結(jié)果

經(jīng)測(cè)定，原料(魚糜漂洗液)中含蛋白質(zhì)0.64%、水分98.70%；濾渣中蛋白質(zhì)占15.4%、水分占82.30%；濾液中蛋白質(zhì)含量為0.18%、水分99.74%。濾液及濾渣的固形物中蛋白質(zhì)的純度分別為：

P濾液=蛋白質(zhì)（%）/[1-水分（%）]=[0.18%/（1-99.74%）]×100%=69.23%；

P濾渣=蛋白質(zhì)（%）/[1-水分（%）]=[15.40%/（1-82.30%）]×100%=87.01%；

濾液的密度近似看成為1.0 g/ml。

可以看出濾渣中蛋白質(zhì)的純度竟達(dá)87.01%。濾液中仍含有較豐富的蛋白質(zhì)，其干重可達(dá)0.18%，純度也相當(dāng)高，為69.23%，仍有很大的利用價(jià)值。

3.2 等電點(diǎn)沉淀法的結(jié)果及分析

3.2.1 溶液中蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的確定

經(jīng)測(cè)定，室溫下，溶液用磷酸為pH調(diào)節(jié)劑時(shí)：當(dāng)pH值大于或等于6.28時(shí)，溶液基本保持原狀，不出現(xiàn)混濁現(xiàn)象。pH值小于6.28時(shí)，溶液隨著酸度的增加，溶液開始出現(xiàn)混濁現(xiàn)象了，溶液的混濁度先逐漸明顯后又漸漸變小了；當(dāng)pH值達(dá)5.28時(shí)，溶液混濁現(xiàn)象隨酸度增加又開始消失。因此可以得出以下結(jié)論：濾液的等電點(diǎn)最接近管A5所配溶液，即pH值約為5.28。

以乙酸為調(diào)節(jié)劑的溶液A11～A20對(duì)應(yīng)的pH值如表1所示。

表1 溶液A11～A20（B11～B20）對(duì)應(yīng)的pH值（乙酸）

在室溫下，濾液在使用乙酸調(diào)節(jié)pH值時(shí)，濾液的等電點(diǎn)接近于溶液A16的pH值，其值為5.35。

3.2.2 磷酸對(duì)提取效果的影響

①溶液在不同pH值下與離心后提取物質(zhì)量之間的關(guān)系圖：

圖1 pH值與離心提取物質(zhì)量關(guān)系

由圖1可得：空白樣本A1經(jīng)過離心提取物的百分含量P1為55.56%。

式中：MA1——溶液A1離心干燥提取的質(zhì)量，同理MA5、MB1等；

V溶液A——濾液的實(shí)際加入體積；

P理論——濾液中蛋白質(zhì)的理論百分含量。

當(dāng)pH值為5.28時(shí)，即溶液在其蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)下，離心提取最多的量P2為90.28%。

②產(chǎn)生明顯分層現(xiàn)象后（靜置約90 min），在溶液B1～B10中，選出分層的溶液，除去上清液，取絮狀沉淀物干燥后的質(zhì)量與對(duì)應(yīng)的pH值，如圖2可看出在pH值為5.28時(shí)，即在等電點(diǎn)下，其沉淀量達(dá)到最大，提取率P3為83.33%。

圖2 絮狀沉淀物的質(zhì)量與pH值的關(guān)系

3.2.3 乙酸對(duì)提取效果的影響

①溶液A11～A20靜置，離心，干燥，提取物質(zhì)量與其對(duì)應(yīng)的pH值之間的關(guān)系見圖3。

圖3 pH值與離心干燥質(zhì)量的關(guān)系

由圖3可得：

在pH值為6.69的情況時(shí)，空白式樣A1，離心后蛋白質(zhì)提取率P4為56.25%。

當(dāng)pH值為5.35時(shí)，即等電點(diǎn)下，離心蛋白質(zhì)提取率P5為85.41%。

②產(chǎn)生明顯分層現(xiàn)象產(chǎn)生后（約100 min），在管B11～B20中，選出有分層現(xiàn)象的試管，去上清液，取絮狀沉淀物干燥后所得質(zhì)量與對(duì)應(yīng)的pH值的關(guān)系，見圖4。

由圖4中可看出，當(dāng)pH值為4.0～6.5之間，均有沉淀物出現(xiàn)，在其等電點(diǎn)下（pH值為5.35），其沉淀量達(dá)到最大。其提取率P6為79.86%。

圖4 沉淀物質(zhì)量與pH值的關(guān)系

3.2.4 磷酸與乙酸對(duì)提取效果影響的對(duì)比分析

從提取率來看，磷酸的提取率略高于乙酸，并且在反應(yīng)沉淀出的速率上來看，磷酸的效果優(yōu)于乙酸。在提取物的質(zhì)量上基本都能保證安全，新鮮。

從以上對(duì)比中可得，以磷酸作酸度調(diào)節(jié)劑更適合。

3.3 添加凝聚劑沉淀法的結(jié)果及分析

3.3.1 三氯化鐵對(duì)提取效果的影響

以三氯化鐵為凝聚劑，加入溶液A21～A30，在時(shí)間為0、30、80 min時(shí)溶液的混濁情況見表2。

表2 三氯化鐵凝聚溶液的情況

從表2可看出，在一定范圍內(nèi)，剛開始的混濁度隨著三氯化鐵的加入量的增加而增加，當(dāng)投入量達(dá)到一定量后漸趨于一個(gè)穩(wěn)定數(shù)值。剛開始越混濁的溶液到最后也就越清晰，越清晰則說明沉淀得越完全。去除上清液，將絮狀沉淀物干燥，所得的量與添加的三氯化鐵的量的關(guān)系見圖5。

圖5 三氯化鐵的量與提取物的量的關(guān)系

從圖5可看出，1.0 ml的1%的三氯化鐵溶液于每8.0 ml溶液中，加1 ml水，即達(dá)接近最大值的提取率 P7為79.86%。

3.3.2 氯化鋁對(duì)提取效果的影響

以氯化鋁為凝聚劑，加入 A31～A40溶液，經(jīng) 0、30、80 min，溶液的混濁情況見表3。

表3 氯化鋁凝聚溶液的混濁情況

從表3中可知，其混濁與澄清趨勢(shì)基本與添加三氯化鐵溶液的變化趨勢(shì)相同。

氯化鋁的量與提取物質(zhì)量的關(guān)系見圖6。

圖6 氯化鋁的量與提取物質(zhì)量的關(guān)系

如圖6可得1%的氯化鋁溶液為1.2 ml于8.0 ml濾液中，加0.8 ml水，其提取率P8為77.78%。

3.3.3 明礬對(duì)提取效果的影響

溶液A41～A50是以明礬作為凝聚劑，經(jīng)0、30、80 min，溶液的混濁情況見表4。

表4 明礬作凝聚劑時(shí)溶液的混濁情況

從表4中可看出，其混濁度與澄清趨勢(shì)與三氯化鐵和氯化鋁的變化趨勢(shì)基本相同。

將上清液去除，絮狀沉淀物直接進(jìn)行干燥，其量與沉淀物質(zhì)量的關(guān)系如圖7。

如圖7可見，明礬投入量為1.0mg時(shí)，沉淀物P9得率基本趨于最大，P9為75.69%。

圖7 明礬加入量與沉淀物質(zhì)量的關(guān)系

3.3.4 使用各種凝聚劑的對(duì)比分析

以上三種凝聚劑，在其一定范圍內(nèi)，沉淀物的質(zhì)量都隨著凝聚劑投入量的增加而增加，當(dāng)投放量達(dá)到一定數(shù)值后，可沉淀出的物質(zhì)基本趨于飽和。在最適點(diǎn)下提取率的高低順序?yàn)?三氯化鐵＞氯化鋁＞明礬。

4 小結(jié)

由實(shí)驗(yàn)可知，魚糜漂洗液中蛋白質(zhì)的最適提取方法為等電點(diǎn)提取法，其提取條件在室溫下，以0.1%磷酸調(diào)節(jié)pH值，所加體積比為：V溶液：V磷酸=5：1,靜置時(shí)間約1 h，適當(dāng)延長靜置時(shí)間，沉淀效果更好，沉淀物中水分含量越少。

此方法操作簡單，提取率高，提取影響因素小，成本低，適合于大量的生產(chǎn)。

[1]王天林.酶法水解草魚魚肉蛋白最適條件的研究[J].哈爾濱市食品藥品監(jiān)督管理局,2009(8).

[2]殷學(xué)鋒.新編大學(xué)化學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京：高等教育出版社，2002.

[3]韓喜平.測(cè)定純水pH值方法的改進(jìn)[J].浙江預(yù)防醫(yī)學(xué),2006(03).

[4]劉迎祥，張向京，許建成.從制藥廠廢醪中回收蛋白質(zhì)[J].化工環(huán)保,2000(02).

[5]Onodenalore A C,Shahidi F.Protein dispersions and hydrolysates from shark (Isurus oxyrinchus)[J].Aquat.Food Prod.Technol.,1996(5)：43-59.

[6]周利平.菜籽蛋白水溶液的超濾行為及在線控制膜污染的研究[J].食品與機(jī)械,2006(01).

[7]Abdul2Hamid A,Bakar J,Bee G H.Nutritional quality of spray dried protein rolysate from Black Tilapia (Oreochromis mossambicus)[J].Food Chem.,2002(78)：69-74.