HPLC法測定杯莧甾酮的血藥濃度

266071 濟南軍區(qū)青島第一療養(yǎng)院第一療養(yǎng)區(qū) 潘靖

川牛膝為莧科植物川牛膝(Cyathula officinalis Kuan)的干燥根，主產(chǎn)于四川、云南、貴州等地，具有逐瘀通經(jīng)，通利關(guān)節(jié)，利尿通淋之功，用于胞衣不下、關(guān)節(jié)痹痛等[1]。其所含化合物類型主要有脂肪酸類、甾酮類、異黃酮類、齊墩果酸皂苷類化合物。根據(jù)近年來的文獻報道，蛻皮甾酮有促進蛋白質(zhì)同化作用、抗血小板聚集、降低血糖等明顯的生理活性[2-3]，與川牛膝補肝益腎、強筋健骨功效相符。杯莧甾酮(Cyasterone)(圖1)[4-5]在川牛膝中含量較大[6]，可作為代表性藥物進行藥物代謝動力學(xué)研究。因此本文建立高效液相色譜法測定杯莧甾酮的血藥濃度為其進一步研究提供依據(jù)。

圖1 杯莧甾酮的結(jié)構(gòu)式

1 材料、儀器和動物

實驗動物：大耳兔，體重2.0 kg，由湖州市藥檢所提供。實驗前禁食24 h，自由飲水，室溫飼養(yǎng)。儀器：Waters高效液相色譜儀(515泵、2487紫外檢測器)，7725 i手動進樣閥，針筒式微孔過濾器(0.45 μm，天津市騰達過濾器廠)，GR-202 AND分析天平，UV-754型紫外可見分光光度計，80-2臺式離心機，XW-80 A渦流混旋器，BDS 160電熱恒溫水溫箱。杭州英譜工作站，AS 3120 A超聲儀。藥品和試劑：對照品，自制，TLC及HPLC檢測均為單峰。經(jīng)過UV、IR、MS、1H-NMR、13C-NMR、CD等測試鑒定為杯莧甾酮，純度為99.6%(HPLC-ELSD歸一化法測定)。乙腈、甲醇為色譜純；實驗用水為重蒸去離子水。

2 方法

2.1 給藥 采用灌胃法[7]給藥，家兔稱重2.0 kg，按家兔體重25 mg/kg給藥。精密稱取杯莧甾酮對照品50.0 mg，溶于10 mL蒸餾水中，超聲成混懸液，吸于注射器中給藥。用5 mL蒸餾水清洗注射器。給藥前取血做空白血，給藥后不同時間取血，HPLC法測定兔血漿中杯莧甾酮的含量。

2.2 血樣處理 取兔耳緣靜脈血，每次0.5 mL置于2 mL的真空采血管中(內(nèi)含枸椽酸鈉)，加入乙腈2 mL，渦流混旋10 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液水浴蒸干，殘渣加入0.1 mL流動相超聲溶解，分別過膜，HPLC測定杯莧甾酮的峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲得杯莧甾酮的濃度。

2.3 對照品溶液制備 精密稱取杯莧甾酮11.30 mg，置200 mL量瓶中，加50%甲醇水溶解并稀釋至刻度，搖勻，得56.5 μg/mL。取上述對照品溶液5 mL于50 mL量瓶中，用50%甲醇水定容，搖勻，即得 (每1 mL中含杯莧甾酮5.65 μg)。

2.4 杯莧甾酮的紫外可見吸收光譜 取5.65 μg/mL的對照品溶液，以50%甲醇水作空白，在200～600 nm范圍內(nèi)掃描，得杯莧甾酮紫外可見吸收光譜，可知其在243 nm處有最大吸收。

2.5 數(shù)據(jù)處理 血藥濃度和時間數(shù)據(jù)由3P87軟件處理。

3 血液中杯莧甾酮的含量測定

3.1 測試條件 色譜柱為Symmetry-C18(5 μm，3.9 mm×150 mm)，流動相為乙腈20 g、水80 g、磷酸二氫鉀1.36 g，流速1 mL/min，檢測波長243 nm，進樣量10 μL。柱溫室溫。

3.2 方法學(xué)考察

3.2.1 方法專屬性考察 空白血液、含藥血液樣品和對照品按3.1項方法各進樣10 μL，HPLC圖譜(圖2 A、B、C)。

圖2 色譜圖和線性圖

3.2.2 穩(wěn)定性考察 取處理好的血液樣品，分別于 0 h、2 h、4 h、8 h、12 h 按項方法進樣10 μL，計算杯莧甾酮的峰面積，RSD為2.32%，即樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性好。

3.2.3 線性關(guān)系考察 分別取空白血漿0.5 mL于5個試管中，分別加入杯莧甾酮對照品溶液，制成濃度分別為：0.565 μg/mL、1.130 μg/mL、2.260 μg/mL、4.520 μg/mL、9.040 μg/mL。按2.1項下血樣處理過程處理后分別進樣10 μL，3針/次，記錄其峰面積。以杯莧甾酮峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，杯莧甾酮的進樣濃度(X)為橫坐標(biāo)，由HS色譜數(shù)據(jù)工作站計算得杯莧甾酮回歸方程為Y=17 715X＋759.517，r=0.999 0，在 0.565～9.040 μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好(圖2 D)。

3.2.4 回收率和精密度試驗 于空白血液中加入高、中、低3個不同濃度的杯莧甾酮對照品液，制備得到分別含杯莧甾酮濃度為 9.040、2.260、0.565 μg/mL血液樣品，測定3個濃度血液中杯莧甾酮的回收率分別為：89.7%、90.2%、93.5%，平均回收率為91.1%，RSD=2.25%(n=5)，日內(nèi)精密度RSD=±3.9%，日間精密度RSD=±7.3%。

圖3 杯莧甾酮的血藥濃度-時間曲線

4 結(jié)果與結(jié)論

家兔經(jīng)口服給藥后，杯莧甾酮在家兔體內(nèi)吸收很快，20 min血液中可檢出杯莧甾酮(圖3)；HPLC法測定家兔血液中杯莧甾酮的濃度，分離度好，方法簡便、靈敏，可用于杯莧甾酮的血藥濃度測定和進一步進行藥物代謝動力學(xué)研究。

5 討論

1)血樣的處理：作者先后采用多種蛋白沉淀方法，和多種萃取方法，包括甲醇、乙腈、丙酮、高氯酸、硫酸銨等方法。結(jié)果表明，杯莧甾酮提取率在乙腈、甲醇中較高，且在乙腈中提取較干凈、無干擾。因此采用乙腈沉淀蛋白并提取，方法簡單，提取率又高。

2)本文采用乙腈20 g、水80 g、磷酸二氫鈉1.20 g作為流動相測定兔血漿中杯莧甾酮的濃度，杯莧甾酮的保留時間為14.4 min，平均回收率為85.5%。本方法操作省時、簡便，精密度及重現(xiàn)性均較好[8-11]。

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