薛晶 肖麗英 周學(xué)東

（口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川大學(xué)，四川 成都 610041）

隨著生命科學(xué)研究的不斷發(fā)展，人類邁入后基因組時(shí)代。人體的健康決定于基因與環(huán)境的相互作用，目前大量的研究集中在分析人的基因組成與疾病易感性和藥物敏感性的關(guān)系上。但是，在體內(nèi)發(fā)揮作用、影響人們生老病死的不僅有人的基因，還有大量的共生微生物的基因，其遺傳信息的總和稱為微生物組。只有人體基因組與微生物組“和諧一致，協(xié)調(diào)行動(dòng)”才能保證人體的健康。因此，在研究基因與人體健康關(guān)系時(shí)一定不能忽略共生微生物的基因。2007年12月美國(guó)《科學(xué)》雜志預(yù)測(cè)：人體共生微生物的研究將可能是國(guó)際科學(xué)研究在未來取得突破的7個(gè)重要領(lǐng)域之一。本文將簡(jiǎn)要介紹人體微生物組、人體口腔微生物組以及微生物基因研究新技術(shù)的最新進(jìn)展。

1 人體微生物組

在人體內(nèi)部或體表活躍著數(shù)以萬計(jì)的微生物個(gè)體，包括細(xì)菌、古細(xì)菌、真菌和病毒等。這些微生物占人體總身體質(zhì)量的1%～2%，數(shù)量估計(jì)是人體細(xì)胞和生殖細(xì)胞數(shù)量的10倍，它們對(duì)人體的健康有著至關(guān)重要的作用，如幫助消化食物、合成維生素等，而同時(shí)還有一些微生物則可能導(dǎo)致疾病。這些生活在人類體內(nèi)的微生物被稱為微生物群，它們的基因組被定義為微生物組。人體微生物組的概念最先由Lederberg等[1]提出，指的是在人體內(nèi)或者表面存在的生態(tài)群落中共生、共棲和致病的微生物的總稱。如果將人定義為一個(gè)微生物和人體細(xì)胞的復(fù)合體，人類基因的范疇就包括人類基因組和微生物組的組合，人的新陳代謝功能也混合了人和微生物的特性，人類是由細(xì)菌和人體細(xì)胞共同組成的一個(gè)“超生物體”。

目前對(duì)健康和疾病狀態(tài)下這些細(xì)菌、真菌和其他微生物的作用還所知甚少。最近的研究顯示，微生物在疾病方面，如潰瘍、心臟病和肥胖癥等中扮演著重要的角色。為揭示人體健康、疾病狀態(tài)與人體微生物組的關(guān)系，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（national institutes of health，NIH）于2007年12月19日宣布啟動(dòng)一項(xiàng)新的基因工程——人體微生物組項(xiàng)目（human microbiome project，HMP）[2]。

作為NIH生物醫(yī)學(xué)研究路標(biāo)計(jì)劃的一部分，NIH將在未來5年內(nèi)在HMP上投資1.5億美元。其主要目標(biāo)之一是闡明微生物組及影響構(gòu)成微生物分布和進(jìn)化的因素，以更好地理解人類遺傳及生理多樣性，其結(jié)果可能為當(dāng)代人類進(jìn)化提供一個(gè)新的視角，即：迅速發(fā)展的科學(xué)技術(shù)、人類的生活方式和生物圈發(fā)生的變革，是否影響著“微觀進(jìn)化”，從而影響人類對(duì)健康和各種疾病的易感性。通過宏基因組學(xué)方法和傳統(tǒng)基因組DNA測(cè)序方法的協(xié)調(diào)應(yīng)用，HMP將為進(jìn)一步研究人體相關(guān)微生物群落奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

HMP的研究目標(biāo)是確定個(gè)體之間是否有共同的核心人體微生物組的存在，加深對(duì)人體微生物組的變化是否與人體健康狀況相關(guān)的理解，開發(fā)實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)所需要的新技術(shù)和生物信息學(xué)工具，處理伴隨HMP項(xiàng)目相關(guān)的倫理、法律和社會(huì)問題。

HMP的實(shí)施主要包括以下內(nèi)容：首先對(duì)500種新的參考細(xì)菌的基因組進(jìn)行序列測(cè)序，通過合并其他國(guó)際資助項(xiàng)目獲得的微生物基因組信息，從而形成涵蓋大約1 000種微生物基因組的數(shù)據(jù)庫(kù)；然后研究人員將對(duì)取自于健康志愿者身體5個(gè)部位（消化道、口腔、皮膚、鼻腔和女性泌尿生殖道）組織樣本內(nèi)的微生物群落進(jìn)行分析；最后將從患有特定疾病的志愿者體內(nèi)獲得樣本，從而可以將微生物組在人體特定區(qū)域的存在及變化情況與特定的疾病建立聯(lián)系。

目前人體微生物組仍是一個(gè)未知的領(lǐng)域，HMP的最終目的是通過研究獲得的數(shù)據(jù)、工具和資源更充分地了解其變化在人類健康和疾病中的作用，它的實(shí)施將對(duì)疾病的預(yù)防、診斷及治療產(chǎn)生重大的影響[3-4]。

2 人體口腔微生物組

健康人的口腔包含有超過600種不同的細(xì)菌、病毒和真菌等微生物物種，大部分可以相互關(guān)聯(lián)并形成生物膜，抵抗機(jī)械清除力或抗生素治療，但在環(huán)境變化或其他口腔情況（如個(gè)人口腔衛(wèi)生質(zhì)量）變化觸發(fā)時(shí)它們也可成為致病微生物。大量的臨床研究[5]顯示，口腔微生物群與齲病和牙周病有著密切的關(guān)系。隨著人體微生物組項(xiàng)目的開展，對(duì)人體口腔微生物組的研究也日漸增多，NIH牙顱頜面研究所（national institute of dental and craniofacial research，NIDCR）于2008年啟動(dòng)了第一個(gè)口腔微生物組綜合數(shù)據(jù)庫(kù)——人體口腔微生物組數(shù)據(jù)庫(kù)（human oral microbiome database，HOMD）。HOMD于2008年3月25日正式對(duì)公眾開放，它是由美國(guó)波士頓福賽斯研究所和倫敦國(guó)王學(xué)院的科學(xué)家聯(lián)手建立的，對(duì)口腔細(xì)菌的類型、新陳代謝、致病能力等進(jìn)行了詳細(xì)記錄，提供了它們的數(shù)千種基因。該數(shù)據(jù)庫(kù)的網(wǎng)站地址為http://www.homd.org。數(shù)據(jù)庫(kù)的詳細(xì)資料將口腔細(xì)菌的DNA、蛋白質(zhì)信息和相關(guān)論文關(guān)聯(lián)在一起[6]，方便使用者查詢。

HOMD的目標(biāo)是提供大約600種人體口腔原核生物物種群落的全面信息。這些微生物物種的44%可培養(yǎng)并已命名；11%可培養(yǎng)但尚未命名；還有45%無法培養(yǎng)，但可用分子生物學(xué)研究手段，通過它們的16S rRNA序列來辨認(rèn)其DNA指紋。16S rRNA序列是科學(xué)家們?cè)谶^去20年中用來識(shí)別微生物遺傳信息的獨(dú)特指紋。這一序列信息可以使微生物通過一個(gè)家族樹來顯示它們的相互關(guān)系。對(duì)于那些DNA已被測(cè)序的微生物，HOMD提供在線工具來查看和分析它們的基因和蛋白質(zhì)。每個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息類別都是相互關(guān)聯(lián)的，易于檢索、注釋，并經(jīng)常更新。HOMD提出了一個(gè)對(duì)目前未命名物種的命名方案，使菌株、克隆以及從任何實(shí)驗(yàn)室探測(cè)得到的數(shù)據(jù)可以直接鏈接到一個(gè)穩(wěn)定的有名參考微生物實(shí)體。HOMD將序列信息與表型、系統(tǒng)發(fā)育、臨床和書目信息數(shù)據(jù)等相關(guān)聯(lián)。全部和部分口腔細(xì)菌的基因組序列已被確定為HOMD項(xiàng)目和人體微生物組項(xiàng)目的一部分，HOMD同時(shí)提供可方便查看所有公開口腔細(xì)菌基因組的工具[7-8]。

NIDCR Lawrence Tabak博士認(rèn)為，HOMD的建立填補(bǔ)了尖端研究的需要，口腔微生物組包含極其豐富的數(shù)據(jù)，HOMD未來將成為科學(xué)家查看和檢索口腔微生物群信息、形成新的科學(xué)假設(shè)和獲得計(jì)算發(fā)現(xiàn)的重要搜索引擎，并最終開發(fā)出更完善的生物治療方法來控制口腔疾病[9]。

除了HOMD外，人們還開展了對(duì)正常人口腔唾液微生物組和核心微生物組的研究。Nasidze等[10]學(xué)者分別從北美、南美、歐洲、亞洲以及非洲等不同地區(qū)提取了120個(gè)人的唾液樣本，通過對(duì)這些唾液樣本的14 115個(gè)16S rRNA基因進(jìn)行測(cè)序和分析，結(jié)果識(shí)別出了101種已知的細(xì)菌類，其中有39種是從未在口腔中發(fā)現(xiàn)過的。此外，還至少發(fā)現(xiàn)了64種未知的細(xì)菌類。這些研究結(jié)果提示口腔微生物組因個(gè)體的不同在組成上也存在著很大的差異，并且不受任何地區(qū)結(jié)構(gòu)的影響。研究旨在建立健康個(gè)體唾液細(xì)菌的范圍，以期對(duì)未來的疾病診斷提供幫助。Zaura等[11]學(xué)者利用454焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了3名正常高加索人口腔內(nèi)5個(gè)部位的微生物組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正常人口腔中有3 600種獨(dú)特序列，超過500種不同的分類單元或“物種級(jí)”表型和88～104種高級(jí)分類群（屬或更具包容性的類群）。每個(gè)單獨(dú)的樣品平均藏匿有266種“物種級(jí)”表型，頰部樣本多樣性最小，牙齒鄰面樣本多樣性最高。主成分分析結(jié)果顯示來源于牙面的樣本占據(jù)了所有部位的主要構(gòu)成。從3個(gè)個(gè)體微生物組測(cè)序結(jié)果分析可知，高級(jí)分類群、“物種級(jí)”表型和獨(dú)特序列都有一個(gè)較大的重疊，84%的高級(jí)分類群，75%的分類單元和65%的獨(dú)特序列至少在3個(gè)微生物組中的2個(gè)存在。這3個(gè)個(gè)體的總共6 315個(gè)獨(dú)特序列中有1 660個(gè)相同序列，這1 660個(gè)相同序列，即“核心微生物組”貢獻(xiàn)了66%的測(cè)序內(nèi)容，重疊的分類單元貢獻(xiàn)了94%的內(nèi)容，而幾乎所有的內(nèi)容（99.8%）都屬于共享的高級(jí)分類群。研究證實(shí)，不同的健康人口腔細(xì)菌大部分微生物組是相同的，提示可能存在健康口腔核心微生物組。

如何使口腔微生物組有助于健康和疾病防治吸引了許多細(xì)胞生物學(xué)家、微生物學(xué)家和免疫學(xué)家越來越多的興趣，這些研究將明確如何調(diào)控微生物群才能使其有助于維持健康，如在齲齒和牙周病中通過干擾微生物的群落動(dòng)力而發(fā)揮預(yù)防作用。另一方面，相關(guān)研究人員目前也正在探討口腔微生物群和某些全身性疾病之間的聯(lián)系。

3 口腔微生物組研究新技術(shù)

對(duì)口腔微生物組的認(rèn)識(shí)很大程度上依賴于研究手段。根據(jù)Staley等[12]的觀點(diǎn)，低于1%的微生物可以在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下生長(zhǎng)，提示以培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)研究口腔微生物菌群的復(fù)雜性和基因多態(tài)性具有嚴(yán)重偏差?，F(xiàn)代生物技術(shù)以DNA為基礎(chǔ)的一系列研究方法，如16S rRNA基因技術(shù)、高通量指紋技術(shù)、宏基因組學(xué)技術(shù)以及下一代測(cè)序技術(shù)，使人類可以在結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和基因多態(tài)性的意義下更清晰地研究和了解人體微生物菌群[13]。

3.1 16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)

1985年開始應(yīng)用的PCR技術(shù)開啟了對(duì)以前未知微生物群落的非培養(yǎng)依賴性分析和鑒別，包括口腔生物膜中的常駐微生物。Woese[14]發(fā)現(xiàn)，16SrRNA構(gòu)成了原核細(xì)菌核糖體亞基的一個(gè)保守序列。所有物種的16S rRNA序列的部分區(qū)域是高度保守的，而其他區(qū)域則變化較大。保守的區(qū)域，可從基因組DNA序列擴(kuò)增16S rRNA序列，而多變的區(qū)域則經(jīng)常根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育用于生物分類。因此，16SrRNA序列對(duì)基因組研究特別有用，可以幫助確定在一個(gè)給定的樣本中有哪些生物分類群的存在以及它們的豐度如何。編碼16S rRNA基因順序的保守性和多樣性使從種屬水平構(gòu)建細(xì)菌進(jìn)化樹關(guān)系成為可能。16S rRNA序列可從2個(gè)方面獲得：通過宏基因組DNA樣本使用不同的引物專門地?cái)U(kuò)增獲得，也可通過宏基因組DNA序列的傳統(tǒng)全基因組鳥槍法測(cè)序隨機(jī)獲得。一般來說，第2種方法獲得的16S rRNA序列會(huì)減少，但同時(shí)消除了PCR反應(yīng)的誤差。

3.2 高通量指紋技術(shù)

采用高通量指紋技術(shù)檢測(cè)環(huán)境微生物群落，可以直接檢測(cè)從微生物群落樣本中提取的核酸，以PCR為基礎(chǔ)，如變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gelelectrophoresis,DGGE）[15]，溫度梯度凝膠電泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）[16]，末端限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性（terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）[17-18]。這些技術(shù)已經(jīng)被學(xué)者廣泛地用來研究人體口腔微生物的種屬。

DGGE/TGGE是一種以PCR為基礎(chǔ)的微生物群落分析方法，將特定微生物群落DNA庫(kù)中的標(biāo)記基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR混合產(chǎn)物進(jìn)行DGGE/TGGE，不同順序成分的DNA在不同變性濃度下變性，表現(xiàn)出凝膠上的不同條帶，形成不同的條帶模式，理論上認(rèn)為一個(gè)條帶就代表菌落中的一種不同種屬的細(xì)菌。實(shí)驗(yàn)所獲得的指紋圖譜反應(yīng)了群落的結(jié)構(gòu)，包括其復(fù)雜性以及每一個(gè)被檢測(cè)種屬的相對(duì)含量。將凝膠上的條帶進(jìn)行回收、克隆及測(cè)序，便可鑒定對(duì)應(yīng)微生物的種屬。

T-RFLP是廣泛應(yīng)用于環(huán)境微生物群落的評(píng)價(jià)及不同生態(tài)系統(tǒng)復(fù)雜性和基因多態(tài)性比較的替代性分子學(xué)技術(shù)，也是以PCR為基礎(chǔ)，對(duì)一定的目標(biāo)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用熒光標(biāo)記的引物，得到有熒光標(biāo)志的PCR混合產(chǎn)物。由于從不同種屬細(xì)菌擴(kuò)增來的目標(biāo)基因可能在不同的位置含有不同數(shù)量的限制性內(nèi)切酶片段，用特定的內(nèi)切酶水解PCR產(chǎn)物，就會(huì)產(chǎn)生不同反應(yīng)的被測(cè)微生物群落特征的條帶模式，或“指紋”。由于末端限制性酶切片段長(zhǎng)度可由已知的16S rRNA或其他目標(biāo)基因序列預(yù)知，因此建立數(shù)據(jù)庫(kù)相對(duì)較容易，每次T-RFLP所測(cè)的結(jié)果可以通過將結(jié)果峰與已有數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較而進(jìn)行便捷的闡釋。

指紋技術(shù)較16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)雖然可對(duì)整個(gè)微生物群落進(jìn)行分析，獲得微生物組的情況，然而，不同指紋技術(shù)的研究結(jié)果很難進(jìn)行比較，并且不能檢測(cè)微生物的分類和功能[13]。

3.3 宏基因組學(xué)技術(shù)

“宏基因組”是由Handelsman等[19]1998年提出的，包含了比可培養(yǎng)微生物大得多的遺傳信息，其定義是生物環(huán)境中全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和。宏基因組目前主要是指環(huán)境樣品中細(xì)菌和真菌的基因組總和，其文庫(kù)既包括了可培養(yǎng)的和未培養(yǎng)的微生物遺傳信息，因此提供了獲得新生物活性物質(zhì)的機(jī)會(huì)。宏基因組學(xué)的基本方法是分析微生物環(huán)境中的基因組組合，直接分離未培養(yǎng)微生物基因組DNA，將其克隆到可培養(yǎng)的微生物中，最后篩選出所需的。

3.4 焦磷酸測(cè)序技術(shù)

焦磷酸測(cè)序技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種新的下一代序列分析技術(shù)，它通過核苷酸和模板結(jié)合后釋放的焦磷酸引發(fā)酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使熒光素發(fā)光并進(jìn)行檢測(cè)，是一個(gè)理想的遺傳分析技術(shù)平臺(tái)，既可進(jìn)行序列分析，又可進(jìn)行基于序列分析的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)及等位基因頻率測(cè)定等[20]。焦磷酸測(cè)序技術(shù)的建立與應(yīng)用使得高通量準(zhǔn)確測(cè)定特征序列、有效進(jìn)行微生物的分型鑒定成為可能。

焦磷酸測(cè)序技術(shù)的核心是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，這4種酶分別為：DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶，反應(yīng)底物為5′-磷酰硫酸、熒光素，反應(yīng)體系還包括待測(cè)序DNA單鏈和測(cè)序引物。在每一輪測(cè)序反應(yīng)中，只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對(duì)，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸基團(tuán)。焦磷酸基團(tuán)可最終轉(zhuǎn)化為可見光信號(hào)，并由焦磷酸測(cè)序儀器轉(zhuǎn)化為一個(gè)峰值，每個(gè)峰值的高度與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目是成正比的。然后加入下一種dNTP，繼續(xù)DNA鏈的合成。每一個(gè)dNTP的聚合與一次熒光信號(hào)的釋放偶聯(lián)起來，以熒光信號(hào)的形式實(shí)時(shí)記錄模板DNA的核苷酸序列。

4 結(jié)語

人類口腔微生物與人體始終處于動(dòng)態(tài)生態(tài)平衡狀態(tài)，為維護(hù)人體的健康發(fā)揮重要的作用，也與多種口腔疾病的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，因此，對(duì)這些微生物的基因進(jìn)行全面測(cè)序和對(duì)它們的生理功能進(jìn)行深入解析，可為各類疾病的預(yù)防和治療帶來全新的思路和方法。人類口腔微生物組數(shù)據(jù)庫(kù)的建立為人們了解、認(rèn)知復(fù)雜的口腔微生物環(huán)境提供了一個(gè)嶄新的平臺(tái)，為各種口腔疾病的預(yù)防和治療奠定了基礎(chǔ)。

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