葛 凱 王桂軍 李培英 夏倫斌 陳習中 左瑞華

（①皖西學院生物與制藥工程學院 安徽六安 237012 ②安徽農業(yè)大學動物科技學院 合肥）

小鵝瘟病毒蛋白質的研究概況

葛 凱①王桂軍②李培英②夏倫斌①陳習中①左瑞華①

（①皖西學院生物與制藥工程學院 安徽六安 237012 ②安徽農業(yè)大學動物科技學院 合肥）

小鵝瘟是雛鵝的一種急性或亞急性敗血性傳染病，其病原體是小鵝瘟病毒(Gosling Plague virus，GPV)，即鵝細小病毒(Goose Parvovirus，GPV)。該病是我國學者方定一于1956年首次在江蘇揚州發(fā)現，60年代后，在歐洲、亞洲等國家相繼報道該病的發(fā)生與流行。1974年，國際禽病學會(WPSA)正式將該病命名為Derzsys氏病。該病主要侵害出殼后4～20日齡的鵝雛，也感染鴨雛，傳播速度快，發(fā)病率和死亡率較高。臨床以腹瀉、呼吸困難、腳軟、滲出性腸炎為主要癥狀。細小病毒感染已成為水禽養(yǎng)殖業(yè)中危害比較嚴重的病原，給水禽養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的損失[1]。為更深入的認識GPV的生物學特性，有效防制小鵝瘟，近年來很多學者對其病毒蛋白質進行了大量的研究。

1 GPV的生物學特性

GPV屬細小病毒科細小病毒屬，病毒外觀呈圓形或六角形，無囊膜，20面體對稱，直徑約20～25nm，空心內直徑為15nm，外殼厚5nm，對角直徑為25nm[2]。具有感染性的病毒粒子為110S，缺少DNA的病毒粒子為65S。GPV對外界因素具有很強的抵抗力，56℃加熱1h仍能使鵝胚死亡。病毒對乙醚、氯仿、胰酶有抵抗力，對紫外線敏感。

GPV屬于自主性細小病毒。無需輔助病毒可自主復制。其基因組是在被感染細胞的染色體復制開始以后在細胞核內合成。因此，必須在細胞培養(yǎng)同時接種病毒，這樣才能達到使病毒增殖的目的。GPV 的復制主要在細胞核內進行，并形成大型包涵體，在細胞培養(yǎng)物中隱藏期約10～16h，接種后10～24h，在病毒DNA合成的同時，形成細胞核內抗原并出現病毒粒子。

2 GPV的蛋白質

2.1 非結構蛋白 GPV的非結構蛋白Rep1和Rep2位于基因組左側閱讀框(LORF)，在GPV的537bp的第1個ATG起始Rep1，在1065bp的第2個ATG起始Rep2，兩者共同終止于2418bp的UAA密碼子。其基因長度分別為1884和1356bp，編碼的Rep1和Rep2相對分子量大小分別約為68.7和49kDa，Rep1和Rep2蛋白多肽分別由627個和451個氨基酸組成。Rep蛋白在病毒復制早期產生，其功能主要是參與病毒DNA的復制和基因表達的調節(jié)[3]。Rep1為磷酸化蛋白，同參與調節(jié)啟動子的細胞因子結合，在細小病毒DNA早期復制過程有多種功能：①可與病毒DNA復制起始序列高親力結合，對病毒DNA的復制是必須的；②抑制細胞DNA的復制；③對衣殼蛋白的啟動子起正調節(jié)作用；④對P41啟動子起負調節(jié)作用。非結構蛋白Rep1不僅在病毒的生活周期中起著十分重要的調控作用，而且具有抑制多種腫瘤發(fā)生的能力。這一現象的可能原因是：腫瘤組織為細小病毒的繁殖提供了適宜環(huán)境，而Rep1蛋白的形成可干擾細胞中一個14 kDa的蛋白質的磷酸化作用，進而抑制細胞DNA的合成并表現出毒性作用，從而使細小病毒表現出溶瘤作用[4]。

GPV Rep1蛋白能共價結合于復制型DNA 5’末端，具有特異部位的解旋活性，并且其具有保守序列GPTTGKE[3]。目前認為該類保守序列是ATP結合部位，具有DNA解旋活性，拓展了GPV DNA末端空間構型，并起始病毒DNA的復制，GPV Rep2蛋白氨基酸序列按肽鏈C端到N端方向同Rep1蛋白完全重疊。GPV Rep2蛋白同Rep1蛋白對細胞的毒性有協(xié)同作用，但Rep2蛋白對細胞毒性作用很小，它能促進Rep1蛋白對細胞的毒性作用。此外Rep2蛋白還可能與病毒DNA和蛋白質有效合成以及病毒增殖有關[5]。

2.2 結構蛋白 GPV的結構蛋白研究的比較深入，它是病毒的衣殼蛋白，參與病毒的免疫。GPV共有3種結構蛋白，分別為VP1，VP2和VP3，位于基因組右側開放閱讀框架(RORF)。編碼VP1，VP2和VP3蛋白的起始密碼子分別位于2439，2874和3033bp，共同終止于4635bp。但Zadori等[6]對GPV全基因序列分析時發(fā)現，右側閱讀框中僅有2個ATG 密碼子，從ATG所在核苷酸的位置來看，它們分別為VP1和VP3蛋白的起始密碼子。通過與腺聯病毒-2(AAV2)序列比較及從SDS-PAGE表現的蛋白帶大小推測，GPV VP2蛋白的起始密碼子為不典型的ACG。編碼VP1，VP2和VP3蛋白的基因長度分別為2199，1764和1605 bp；通過ORF推測VP1，VP2和VP3蛋白的大小分別是81.3，65.0和57kDa，但SDS-PAGE估計的3種蛋白質大小卻分別是87，73和60kDa；VP1，VP2和VP3蛋白多肽分別由732，587和534個氨基酸組成。GPV的VP1和VP2是從P41啟動子(位于VP1起始密碼子之前的潛在啟動子，為TTTTAA)轉錄的mRNA的選擇性拼接位點翻譯而來，VP1包含整個VP2的序列，VP2從mRNA的2455nt處的剪接受體位點剪接加工后翻譯出VP2和VP3，而VP3是在整個核衣殼形成之后從VP2氨基端剪去部分氨基酸形成的。因此VP1蛋白多肽氨基酸序列與VP2按肽鏈C端到N端方向完全重疊，VP3蛋白多肽氨基酸序列與VP2和VP1按肽鏈C端到N端方向完全重疊。張云等[7]研究表明，GPV的結構蛋白處于219～221，582～584，700～702，712～714位氨基酸，都是潛在的糖基化位點。

衣殼蛋白VP1，VP2和VP3是決定GPV病毒嗜性、宿主域和致病性的關鍵因素。其中VP1可協(xié)助病毒或其DNA通過核孔轉運至細胞核內，可與宿主細胞的特殊受體結合，使病毒粒子進行有效感染[8]。Tullis等[9]證實VP1蛋白是小鼠細小病毒復制和病毒粒子包裝必需的一種結構蛋白，缺失VP1的病毒突變體的克隆，轉染敏感細胞后，盡管仍可起始DNA復制并產生子代病毒，但已喪失對細胞的感染性，即不能產生感染性病毒粒子。VP1與細胞的結合是一種特異性受體結合，因此推測GPV VP1蛋白在病毒侵襲細胞并產生感染性方面是一個重要的結構區(qū)域。如果編碼VP1蛋白的基因缺失，可能會影響GPV復制和病毒粒子包裝，形成缺損子代病毒，喪失對細胞感染的能力。另外VP1 N端富含堿性殘基，存在類似SV40和多瘤病毒VP1蛋白N端的核內定位信號序列，這種序列信號特征對于其在細胞核內定位至關重要。在GPV VP1多肽第56位氨基酸處有相對保守的結構域“PGY”，無感染性缺損病毒的基因組中沒有這種保守結構域，因此推測“PGY”保守結構域可能是產生完整病毒結構蛋白和成熟病毒粒子必不可少的功能結構區(qū)域。

VP2是主要免疫功能區(qū)，可刺激機體產生中和抗體，在沒有VP1存在條件下VP2可自我組成病毒樣顆粒。Strassherme等[10]研究犬細小病毒衣殼蛋白時發(fā)現，2個決定中和抗體產生位點區(qū)，一個位于纖突頂端，另一個位于VP2第300氨基酸殘基周圍及三倍體纖突的“肩部”，堿基突變可引起病毒抗原性的變化。犬細小病毒衣殼蛋白中有10個抗原表位，免疫吸附試驗表明，其中6個抗原位于病毒表面，3個位于VP2氨基端，3個位于病毒三重對稱軸上形成“穗狀突起”的VP2的“環(huán)”上，說明VP2是刺激機體產生中和抗體的主要部位。推測GPV VP2蛋白可能參與GPV DNA的包裝，與VP1一起協(xié)同作用，形成具有感染性的病毒粒子。

GPV VP3蛋白是病毒的主要衣殼蛋白，約占衣殼蛋白總含量的80%。Zadori等[6]通過GPV衣殼蛋白三維結構模擬比較分析發(fā)現，暴露于病毒粒子表面的氨基酸序列均出現在VP3蛋白多肽鏈內，表明VP3內含有GPV主要抗原決定簇成分，是GPV主要免疫保護性抗原，能誘導機體產生具有中和作用的抗體。李新華(1998年)用淋巴細胞雜交瘤技術研制出7株抗GPV單克隆抗體，均同時與GPV的VP2和VP3多肽鏈發(fā)生反應，表明VP2和VP3都為GPV的免疫保護性抗原，能夠刺激機體產生具有中和作用的抗體，2種結構蛋白多肽之間可能含有一些相同的抗原決定簇成分。盧菲等[11]研制VP3基因疫苗，免疫小鼠后能誘導產生細胞免疫和體液免疫應答，并且基因疫苗的免疫效果比弱毒疫苗要強。余兵等[12]用地高辛標記VP3基因的部分序列作為核酸探針，分析發(fā)現該序列具有很高的保守性。

3 GPV蛋白質的體外表達

目前報道的鵝細小病毒蛋白已在大腸桿菌、痘病毒、桿狀病毒等載體中進行了表達，且主要集中在結構蛋白，非結構蛋白報道較少。賀云霞等[13]將GPV VP2基因亞克隆在原核表達載體pPROEX-HTb上，IPTG誘導后成功表達出與預期大小相符的約72 kDa的融合蛋白，光密度掃描對表達產物進行初步定量，表明表達產物約占菌體總蛋白的14%。表達產物經Ni-NTA金屬鏊合層析柱純化后，得到了純度較高的6His-VP2融合蛋白，采用Western-blot方法檢測結果表明所得的6His-VP2融合蛋白具有較好的反應原性。馬君等[14]將GPV主要結構蛋白VP2和VP3基因插入到原核表達載體pET-28b中，為高效原核表達打下基礎。李雪梅等[15]則將GPV的VP2-VP3基因插人到原核表達質粒PET-28a的多克隆位點上，構建了原核表達載體pEGVP1，將它轉化到宿主表達菌BL21中，經IPTG誘導，SDS-PAGE電泳可見表達產物的分子量均約為75kDa，Western- blot檢測表達產物與相應抗體具有一定的反應原性。同時還將其克隆到核酸疫苗質粒pIRES1-neo載體上，構建了核酸疫苗重組質粒pIGVP1，再將重組質粒轉染到鵝胚成纖維細胞上，經Western-blot檢測其表達產物可出現特異性反應帶，證明表達產物具有很好的反應原性。田麗紅等[16]將GPV H1株的VP3基因亞克隆于pSY538的EcoR1位點，然后將帶有痘苗病毒啟動子P11的LacZ報告基因平端克隆于上述重組子的SmaI位點，再用NotI切下同時含有VP3基因和LacZ報告基因的片段，再亞克隆于pSY681的NotI位點，構建出含有VP3基因的重組禽痘病毒轉移載體，為構建表達VP3基因的重組禽痘病毒打下了基礎。 Takeara等[17]將GPV VP1基因克隆到桿狀病毒載體，構建了重組桿狀病毒。該重組病毒表達了與VP1蛋白分子量相符的88 kDa的蛋白，并用免疫印跡法得以檢測。通過間接熒光抗體試驗(IFA)在昆蟲的細胞核中發(fā)現大顆粒的表達蛋白，電鏡觀察在重組病毒感染的核內也發(fā)現有幾個大粒子。雖然表達蛋白聚集成顆粒的原因尚不清楚，但這似乎為重組GPV VP1衣殼蛋白所特有，使用這些顆粒作為IFA抗原，血清滴度與細胞核內獲得的特異性熒光顆粒的最高血清稀釋度成負相關。以上這些都為開發(fā)研制GPV新型分子診斷試劑和抗GPV感染的基因工程疫苗提供了理論和實踐依據。

對非結構蛋白的研究，邢明偉等[18]擴增出了GPV H1株NS2基因，與國外已發(fā)表的GPV B株相比核苷酸序列同源性為98.75%，推導氨基酸序列同源性為98.67%。最近，邢明偉等[19]又將NS2基因亞克隆于原核表達栽體pGEX-6P-1中，獲得重組質粒pGEX-NS2。經過親和層析方法獲得了純化的重組NS2蛋白，檢測結果表明，表達的重組NS2蛋白可以與GPV陽性血清發(fā)生特異性反應。王銳等[20]從分泌抗GPV-NS1單克隆抗體的雜交瘤細胞中克隆得到抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，構建了抗GPV-NS1蛋白單鏈抗體基因，并將其在大腸桿菌中表達，獲得了具有生物活性的單鏈抗體蛋白。

由于GPV 具有許多特性，可以將GPV的VP3基因在乳酸桿菌中進行表達，以研制出口服的GPV基因工程疫苗，主要原因在于：①目前所用的GPV滅活苗和弱毒苗口服在臨床上顯示出較好的免疫效果，說明GPV疫苗可產生較好的黏膜免疫反應，且腸道具有豐富的淋巴器官和免疫細胞，其淋巴細胞約占機體總淋巴細胞的80%左右，因此腸道免疫具有較大的潛力。② GPV VP3基因是病毒的主要免疫原性蛋白，其氨基酸序列的高度保守性正是目前GPV僅有一個血清型的原因所在，且不同來源的毒株變異性較小。劉中勇等[21]分析了7株GPV的不同地方株，發(fā)現其同源性均在93%以上，應用CLUSTAL W軟件分析其相同區(qū)域核苷酸序列發(fā)現其趨異率均小于6%。陳曉月等[22]研究表明，GPV遼寧株基因組中的VP3基因同國外的GPV B株核苷酸序列同源性為98.5%，氨基酸序列同源性為98.3 %。③腸道是GPV首要的感染途徑，且腸道病變最嚴重，說明GPV對腸細胞有很好的嗜性，因此口服免疫可在更早的時間消滅病毒，達到預防的目的。④乳酸桿菌是一種非致病的益生菌，本身就具有抗菌、抗病毒的作用，將兩者聯合應用，可同時發(fā)揮兩者的綜合效應。這些都為研制GPV乳酸桿菌基因工程苗提供了理論上的可行性。

4 展望

盡管 GPV基因組早在1995年就已經測出，但對GPV蛋白質的認識還遠遠不夠，特別是對Rep蛋白的作用機制和功能以及GPV蛋白復制、轉錄與翻譯的特殊性等方面均有待進一步研究。如何提高重組的致弱病毒和細菌對VP蛋白的表達量及在益生菌中有效表達GPV-VP蛋白，以開發(fā)出口服GPV基因工程疫苗，這些都是小鵝瘟以后的研究課題。

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S858.33

C

1007-1733(2010)12-0080-04

安徽省高校省級自然科學研究項目(KJ2010B263)

2010–10–19）

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