付 強 沈志強 劉吉山 李 峰 （山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 256600 ）

雞傳染性鼻炎(infectious coryza，IC)是由副雞嗜血桿菌(haemophilus paragallinarum，Hpg)引起的一種雞急性上呼吸道傳染病。目前本病在世界許多地方都有發(fā)生和流行。本病發(fā)生后可引起蛋雞產(chǎn)蛋量下降，育成雞生長發(fā)育受阻和淘汰率增加，肉雞肉質(zhì)下降，給養(yǎng)雞業(yè)造成重大的經(jīng)濟損失[1]。

免疫接種是預(yù)防本病的主要措施之一。目前主要使用滅活菌苗，國內(nèi)預(yù)防IC以A型、C型單雙價滅活苗為主，Matsumoto M等[2-3]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)卵黃囊接種培養(yǎng)制備的疫苗保護率低于經(jīng)肉湯培養(yǎng)制備的疫苗，而且卵黃中雜蛋白含量較多，粘稠且難于確定疫苗中的總菌數(shù)。肉湯搖瓶培養(yǎng)(生物制品規(guī)程2000版)產(chǎn)量低，成本高，液體發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)能很好的解決此類問題，但國內(nèi)對副雞嗜血桿菌液體發(fā)酵培養(yǎng)工藝的報道不多，為此我們進(jìn)行了多次A、C型IC的發(fā)酵培養(yǎng)試驗，摸索培養(yǎng)條件，取得良好效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 副雞嗜血桿菌Hpg-8，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保存和供應(yīng)，凍干保存。

1.1.2 主要儀器 GUJS-10L型發(fā)酵罐，鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)公司生產(chǎn)。水浴搖床。7200型紫外分光光度計。

1.1.3 培養(yǎng)基 IC瓊脂平板：副嗜血桿菌培養(yǎng)基干粉，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，按說明配制，加入1.5%(W/V)瓊脂粉，115℃高壓滅菌20min，降溫至50℃左右時，加入10%的雞血清和0.05%的輔酶Ⅰ，混勻，傾倒滅菌平皿，4℃保存?zhèn)溆?。搖瓶培養(yǎng)基BHC：半合成培養(yǎng)基，按生物制品規(guī)程2000版配制。發(fā)酵培養(yǎng)基：半合成培養(yǎng)基，按生物制品規(guī)程2000版配制。

1.1.4 其它 雞血清，鄭州益康生物工程有限公司。輔酶I，產(chǎn)地Roche。

1.2 方法

1.2.1 一級種子制備 將菌株HPg-8接種于5日齡SPF雞胚卵黃囊內(nèi)，置37℃繼續(xù)孵育，取30h內(nèi)死亡的雞胚卵黃囊，-20℃冷藏保存，應(yīng)不超過1個月。

1.2.2 二級種子制備 取感染的雞胚卵黃液，劃線接種IC平板，置于含5%～10% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃培養(yǎng)16～18h。挑熒光性強的典型菌落接種于IC平板，置于含5%～10% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃培養(yǎng)16～18h，不超過6代。將菌苔用滅菌BHC洗下，分別接種于400ml BHC中，并加入2%雞血清，置37℃恒溫100rpm震蕩培養(yǎng)7～8h，純檢合格后，做為二級種子，置2～8℃保存。

1.2.3 發(fā)酵種子制備及最佳培養(yǎng)時間和保存期的確定將二級種子按2%接入400mlBHC中，并加入2%雞血清，置37℃恒溫100rpm震蕩培養(yǎng)16h，每1h取5.0ml，進(jìn)行OD值檢測，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，作生長曲線(圖1)。發(fā)酵菌種在搖床培養(yǎng)8h及冷藏后24h、48h各做活菌計數(shù)，觀察活菌數(shù)變化。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)工藝要求 將2.3項培養(yǎng)的種子液4%及發(fā)酵液體積4%雞血清、輔酶I0.003%和0.2%葡萄糖，接種于已滅菌的發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，pH7.2～7.4，攪拌轉(zhuǎn)速150rpm，通氣比為1:4，接種后每隔2h取樣做吸光度檢測和活菌計數(shù)。

1.2.5 收獲及濃縮 按生物制品規(guī)程2000版，濃縮至50億/ml，滅活冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果

2.1 各培養(yǎng)批次發(fā)酵菌種OD值 （見表1）

表1 不同培養(yǎng)時間(h)各培養(yǎng)批次發(fā)酵菌種OD值

圖1 發(fā)酵菌種OD600隨培養(yǎng)時間的變化曲線

OD600生長曲線表明，搖瓶菌種的最佳培養(yǎng)時間控制在8～10h，有利于發(fā)酵時縮短靜止期，超過12h，菌體形態(tài)出現(xiàn)長絲狀，OD值降低，此時細(xì)菌衰亡老化，不適合發(fā)酵罐接種。

2.2 發(fā)酵菌種保存時活菌數(shù)變化曲線

從圖2可以看出，發(fā)酵菌種活菌數(shù)隨時間呈大幅下滑的趨勢，所以菌種培養(yǎng)完畢后應(yīng)及時接罐。

2.3 各批次發(fā)酵培養(yǎng)時OD600值及活菌數(shù) （見表2）

表2 不同培養(yǎng)時間(h)各批次發(fā)酵培養(yǎng)時OD600值及活菌數(shù) (億/ml)

菌種接入約4h后細(xì)菌進(jìn)入對數(shù)增殖期，發(fā)酵10～14h后OD值有下降趨勢。發(fā)酵時產(chǎn)酸，通過流加堿液控制pH值7.4左右。

本試驗條件下培養(yǎng)10h活菌數(shù)的平均值為16.5/ml，菌體形態(tài)均一；培養(yǎng)12 h后活菌菌數(shù)有下降趨勢，平均值為13.4億/ml，鏡檢有長絲狀菌出現(xiàn)，著色淺，有老化跡象，故發(fā)酵培養(yǎng)收獲時間為10～12h即可。

3 討論

培養(yǎng)副雞嗜血桿菌的液體培養(yǎng)基有多種，常見的有：市售副雞嗜血桿菌干粉、半合成培養(yǎng)基和雞血清雞肉湯，胰酪胨大豆肉湯TSA均能支持副雞嗜血桿菌的生長，但從疫苗的生產(chǎn)成本考慮，半合成培養(yǎng)基為最佳選擇。

本研究的試驗結(jié)果表明，副雞嗜血桿菌hpg-8株(血清A型)搖瓶菌種在水浴搖床中振蕩培養(yǎng)8～10h生長達(dá)最高峰，靜置培養(yǎng)時生長較差，與張洪等[4]試驗結(jié)果基本相同。液體發(fā)酵培養(yǎng)10～12h生長達(dá)最高峰，活菌數(shù)為13～16×108/ml，發(fā)酵培養(yǎng)時間不易超過12h。

發(fā)酵培養(yǎng)活菌數(shù)明顯高于雞胚培養(yǎng)方法，適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，但仍需通過濃縮工序進(jìn)一步提高菌數(shù)，以滿足規(guī)程要求，發(fā)酵工藝有待于進(jìn)一步提高。

[1]吳清民. 獸醫(yī)傳染病學(xué)[M]. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社. 2002.

[2]Matsumoto M.Pretective quality of an alum inumhydroxide absorbed broth bacteria against infectious coryza[J].American J Vet Ras, 1975, 6:579-582.

[3]Davis PB,RB Rimler,EB Shotts,et al.Efficacy studies on Haemophilus gallinarum bacterin preparations [M].American Journal of Veterinary Research, 1976, 37:219-222.

[4]張洪,王文泉等. 副雞嗜血桿菌在疫苗生產(chǎn)中生長特性的研究[J].中國獸藥雜志. 2003, 37(5):15-17, 20.