徐靜嫻，劉冰陽，森井英一，青世克之，賈心善，張勁松

（1.中國醫(yī)科大學 附屬第四醫(yī)院眼科中心，眼科醫(yī)院，遼寧省晶狀體學重點實驗室，沈陽 110005；2.中國醫(yī)科大學 第93期臨床醫(yī)學7年制，沈陽 110001；3.大阪大學醫(yī)學院病態(tài)病理教研室，日本 大阪 565-0871；4.中國醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院病理學教研室，沈陽 110001）

癌干細胞是一小群具有在瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)形成克隆，在體內(nèi)移植分析中形成腫瘤的能力的細胞。癌干細胞最初發(fā)現(xiàn)于白血?。?］。近期研究發(fā)現(xiàn)，在長期培養(yǎng)的某些細胞株中也存在癌干細胞［2］。熒光染料Hoechst 33342對普通的癌細胞具有著色作用，但具有干細胞特性的癌細胞對該染料卻具有排除能力，因此應用Hoechst 33342染色可分離癌干細胞。在熒光激活細胞分選分析中，帶有較低水平Hoechst 33342染色的細胞被看作是具有癌干細胞特性的SP（side-population）細胞，相反，帶有較高水平Hoechst 33342染色的細胞被看做是非SP細胞，即MP（main-population）細胞，不具有癌干細胞的特性。Kondo等［2］報告只有SP細胞既能生成SP細胞又能生成MP細胞，而MP細胞不具備這種能力。目前，利用SP細胞分選法來分離干細胞的方法已廣泛應用于氣管干細胞、肺癌干細胞的研究中［3］。

癌干細胞對凋亡具有抵抗性，但其機制目前尚不清楚。對癌干細胞進行抗凋亡能力分析困難的原因之一，就是分離癌干細胞時使用的Hoechst 33342染料具有能夠誘導凋亡的毒性作用［4］。應用熒光激活細胞分選分離出來的SP細胞內(nèi)包含的Hoechst 33342量比MP細胞低，SP細胞對凋亡的耐受性可能歸因于Hoechst 33342的低含量，而非SP細胞本身的特性。因此，為了精確評估凋亡，SP細胞應使用不含有Hoechst 33342的系統(tǒng)進行分離。本研究以人類乳腺癌細胞株MCF7和MDA-MB-231為研究對象，應用Hoechst 33342染色及抗CD55抗體染色，分離出SP和MP細胞、CD55高表達（CD55hi）和CD55低表達（CD55lo）細胞，對比了2群細胞的特性，探討了應用抗CD55抗體染色替代Hoechst 33342染色來分離乳腺癌SP細胞的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

人類乳腺癌細胞株MCF7和MDA-MB-231分別購自美國細胞中心（Rockville，美國）和日本科學研究資源庫（HSRRB，日本）。培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FCS）的 DMEM（Sigma，美國）培養(yǎng)基中。

1.2 方法

1.2.1 分選SP、MP細胞：采用Goodell等［5］分離SP細胞的方法，將細胞以1×106/ml的濃度加入2組培養(yǎng)基中∶第一組培養(yǎng)基中含Hoechst 33342 5 mg/ml，第二組培養(yǎng)基中除了5 mg/mlHoechst 33342外，另加入了戊酸丙胺（verapamil，50 mmol/ml）。37℃培養(yǎng)90 min后，收集細胞。應用含有三維激光的FACSVantage（Becton Dickinson公司，美國）進行分析，識別SP及MP細胞，分離并收集。

1.2.2 分選CD55hi、CD55lo細胞：將細胞以1×106/ml的濃度加入含2%FCS的PBS溶液中，再加入藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）標記的濃度為 5 ml/ml的抗CD55抗體（Immunotech公司，法國），避光染色30 min后，應用FACS Vantage SE分析，確定CD55hi與CD55lo細胞，分離并收集。

1.2.3 測定存活細胞比例：清洗細胞，用不含血清的DMEM懸浮，在96孔培養(yǎng)板中（5×103/孔）培養(yǎng)12或24 h后，行臺盼藍染色，通過隨機計數(shù)5×102個細胞計算臺盼藍陰性細胞的比例。

1.2.4 體外克隆形成分析：用0.1 ml的含10%FCS的DMEM培養(yǎng)基懸浮清洗后的細胞，分別計數(shù)200個細胞，放入1 ml含15%FCS的DMEM的甲基纖維素培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d后，計數(shù)克隆形成的數(shù)目。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)均以±s表示，采用t檢驗進行統(tǒng)計學分析，P<0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SP、MP細胞的分選

用Hoechst 33342染色并應用FACS-Vantage儀分析分選MCF7細胞，結果顯示SP細胞占3.9%（圖1A），在含有戊酸丙胺的溶液中，SP細胞比例明顯降低（從3.9%降至0.03%）（圖1B）。對分選后的SP和MP細胞再行抗CD55抗體染色，可見SP和MP細胞分別位于CD55hi和CD55lo區(qū)域（圖1D）。

2.2 CD55hi、CD55lo細胞的分選

MCF7細胞用抗CD55抗體染色后被分別作為CD55hi和CD55lo細胞分選出來。CD55hi細胞的比例約占0.8%～1.3%。對分選出的CD55hi和CD55lo細胞行Hoechst 33342再染色，可見分別位于SP和MP區(qū)域中（圖2A～C）。

2.3 血清缺失誘導凋亡分析

對MCF7細胞的SP和MP細胞進行分選、清洗后，用不含血清的試劑懸浮，測定到SP細胞中存活細胞的比例（12 h時為93%，24 h時為65%）比MP細胞中（12 h時為79%，24 h時為34%）高（圖1C，P<0.01），表明在血清缺失的情況下，SP細胞比MP細胞存活時間長。同樣，在血清缺失的情況下，甄選出的CD55hi細胞也比CD55lo細胞存活時間長（圖2D）。

2.4 克隆形成能力分析

在含有15%FCS的含甲基纖維素的DMEM培養(yǎng)基中加入CD55hi和CD55lo細胞，CD55hi細胞所形成的克隆數(shù)（51.0±5.8）明顯多于CD55lo細胞（5.3±2.3）（P<0.01）。

2.5 MDA-MB-231細胞株的檢測結果

我們同時對乳腺癌細胞株MDA-MB-231也進行了SP、MP細胞及CD55hi、CD55lo細胞的分選及血清缺失誘導凋亡耐受性的分析，結果與MCF7細胞相似。

3 討論

目前，適合SP細胞分離的表面標記還很有限。ATP結合轉運蛋白G超家族成員2（ATP-binding cassette transporter G2，ABCG2）是骨髓 SP 細胞的標志，然而ABCG2敲除鼠并沒有完全喪失乳腺SP細胞［6］。我們預測SP細胞一定能夠表達某種表面分子，并起到保護細胞免受外源傷害刺激的作用。CD55可能就是這種合適的分子之一。CD55是一種補體調節(jié)蛋白，它能夠防止補體因子在細胞表面的蓄積［7］，在保護癌干細胞免受免疫系統(tǒng)攻擊方面可能起重要作用。CD55的過度表達也是結腸癌愈后不良的可靠指征［8］，在巨大淋巴瘤中，CD55的表達水平與腫瘤的大小及耐藥性呈正相關［9］，在SCID鼠中，CD55的表達敲除降低了前列腺癌細胞株的腫瘤起源性［10］。

本研究根據(jù)CD55的表達水平成功分離出了乳腺癌SP和MP細胞。實驗結果表明，2種乳腺癌細胞株中SP細胞的CD55為高表達；分選的CD55hi和CD55lo細胞，再用Hoechst 33342染色時，分別位于SP和MP區(qū)域中；分選的SP和MP細胞，再用抗CD55抗體染色時，則分別位于CD55hi和CD55lo區(qū)域中；在血清缺失的情況下，CD55hi和CD55lo細胞分別顯示了與SP和MP細胞相似的行為，即CD55hi細胞與SP細胞在體外同樣顯示出對血清缺失誘導凋亡的高耐受性；CD55hi細胞較CD55lo細胞在體外具有更強的克隆形成能力。綜上所述，在乳腺癌中，CD55hi和CD55lo細胞分別可以代替SP和MP細胞，即應用細胞CD55高表達的特性可以替代Hoechst 33342染色來分離乳腺癌SP細胞。

本研究結果提示，CD55hi（SP）細胞比CD55lo（MP）細胞對凋亡刺激具有更高的抵抗性。因此，CD55可以推測為乳腺癌干細胞的一個表面標志，有可能成為針對癌干細胞治療的一個新的靶點。進一步的研究（包括分離CD55hi細胞、評估其腫瘤起源性）將會更深入揭示在癌干細胞分離中CD55高表達的作用。

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