金銀實,胡 毅,王 佳,南光賢*

(1.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院神經內二科,吉林長春 130033;2.吉林大學畜牧獸醫(yī)醫(yī)學院,吉林長春 130062)

疑似肝豆狀核變性ATP7B基因第8外顯子的基因序列分析1例

金銀實1,胡 毅1,王 佳2,南光賢1*

(1.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院神經內二科,吉林長春 130033;2.吉林大學畜牧獸醫(yī)醫(yī)學院,吉林長春 130062)

*通訊作者

肝豆狀核變性(hepatolenticular degeneration,HLD)又稱wilson病(Wilson‘s disease,WD),是由銅代謝障礙引起的常染色體隱性遺傳性疾病。肝豆狀核變性的致病基因為ATP7B基因,該基因的缺陷將會影響所編碼的ATP7B活性,使過量的銅沉積在肝、腦、腎和角膜等組織器官,導致急慢性肝病、神經系統(tǒng)疾病、腎病和角膜色素環(huán)等。我國學者研究表明,8號外顯子的Arg778Leu/Glu突變?yōu)槲覈鳤TP7B基因突變的第一熱區(qū),40.9%的肝豆狀核變性患者可以檢測到該突變,染色體突變率為30.7%[1]。血清銅藍蛋白水平、K-F環(huán)、24小時尿銅含量、肝銅含量等是診斷WD的常用指標,簡單憑借任何一項或幾項指標不能確定或排除WD。其臨床癥狀、體征復雜多樣,往往造成診斷的困難[2-4]。肝豆狀核變性也是可以有效治療的遺傳病之一,其療效及預后與開始治療時間密切相關[5]。如果能在發(fā)病早期甚至發(fā)病前確診,通過藥物治療可以控制病情發(fā)展,提高患者的生活質量。反之,如若未能及時確診,往往會延誤最佳治療時間,導致患者肝、腦、腎等組織器官發(fā)生不可逆性損害,致殘甚至死亡。本文通過對1例疑似肝豆狀核變性病例行遺傳基因分析的方法來確診,并指導治療。

1 資料與方法

1.1 病例資料

楊XX,男,20歲。因右上肢顫動進行性加重2年余于2009年2月20日入我院。該患緣于2年前無明顯誘因出現(xiàn)右上肢震顫,呈進行性加重,靜止時正常,持物或活動時震顫明顯,愈緊張愈明顯,震顫幅度成進行性加重,現(xiàn)走路尚可,持物費勁。病程中伴有雙下肢色素沉著。為求明確診治遂入我院。病程中偶有飲水返嗆,飲食及睡眠良好,大小便如常,體重減輕。既往健康。否認遺傳病家族史,三代以內無類似發(fā)病患者。入院時查體:血壓120/80 mmHg,面色晦暗,肝臟下緣達到肋弓一下3cm左右,未觸及脾,雙下肢黑色色素沉著,神清語明,示齒時雙側面紋對稱,伸舌居中,四肢肌張力、肌力正常,四肢腱反射活躍,雙側有踝陣攣,雙側Babinski征陽性。血清銅藍蛋白正常。頭部CT未見異常。裂隙燈下角膜未發(fā)現(xiàn)K-F環(huán)。

1.2 研究對象

病例組為疑似肝豆狀核變性患者及其母親血樣,加入肝素抗凝備用。正常組為無肝豆狀核變性疾患的正常人。

1.3 基因檢測

1.3.1 制備基因組DNA取外周血5 ml,加入肝素抗凝。

1.3.2 全基因組的提取 使用由V-gene公司購置的Whole Blood Genomic DNA Mini-prep Kit血液基因組提取試劑盒按說明書要求提取全基因組。提取的DNA樣品用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果。

1.3.3 人ATP7B基因序列第8外顯子序列的獲得從 GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索人ATP7B基因序列及其第8外顯子核酸序列。第八外顯子全部序列如下:tcctctgaatgggaaagtatatttcataaacgcccatcacagaggaagaagtactgtcacgactgtgcacaaagctagaggctttgccatccccagggcccttggccctgtgtcgctcattgaactctcctccctacttgctggcagccttcactgtccttgtctttcagctcctcggtgggtggtacttctacgttcaggcctacaaatctctgagacacaggtcagccaacatggacgtgctcatcgtcctggccacaagcattgcttatgtttattctctggtcatcctggtggttgctgtggctgagaaggcggagaggagccctgtgacattcttcgacacgccccccatgctctttgtgttcattgccctgggccggtggctggaacacttggcaaaggtaacagcagcttcaggttcagaaaagagctgctccttcagtaaacaaatctcacttcctctgaacaccatgttta 截取ATP7B全基因序列57 781-58 260 bp,exon8編碼區(qū)為57 951-58 184 bp(黑色斜體標出),長度為234 bp。

1.3.4 設計擴增第8外顯子片段引物序列 利用Premier 5.0程序設計克隆引物序列,上游引物序列為5'-tat ttc ata aac gcc cat cac-3',下游引物序列為5'-gga agt gag att tgt tta ctg aag-3'。根據(jù)設計的引物推測,PCR產物理論長度約為450 bp。

1.3.5 從全基因組中PCR擴增ATP7B exon8目的基因 PCR擴增全部由Gene Amp PCR System 9600完成,啟動子區(qū)的PCR擴增反應體積為50 μ L,反應液含:基因組DNA2 μ L,4 種 dNTP 混合液 4 μ L,DNA聚合酶 1 μ L,10 ×Ex Taq buffer5 μ L,4ddH2O 34μ L 。PCR擴增條件為94℃變性5 min,然后以下列溫度和時間做35個循環(huán):94℃30秒、62℃30秒、72℃30秒,最后72℃延伸7分。

1.3.6 PCR產物檢測 PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增片段大小是否符合要求。

1.3.7 PCR產物原液測序 將PCR產物原液交由上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.3.8 測序結果比對 應用DNAMAN Version 5.2進行核酸及蛋白質序列比對。

2 結果

2.1 WD血液全基因組的獲得 使用Whole BloodGenomic DNAMini-prep Kit血液基因組提取試劑盒提取人血液全基因組。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)。

圖1 人血液全基因組提取電泳分析

2.2 WD基因exon8基因片段的獲得 以人血基因組為模板,Forward primer和Reverse primer為引物進行PCR擴增人ATP7B基因exon8片段,PCR產物理論長度約為450bp可見條帶。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖2)。

圖2 人ATP7B基因exon8片段PCR擴增電泳分析

2.3 ATP7B基因exon8基因片段測序結果 通過PCR產物測序檢測出的突變樣品,經核算比對證實患者ATP7B基因exon8存在Arg778Leu/G2333T錯義突變,同時伴隨Leu700Leu/C2310G同義突變。

3 討論

肝豆狀核變性是較為常見的常染色體隱性遺傳銅代謝障礙疾病,該病通常發(fā)生于兒童期和青少年期,發(fā)病年齡為5-40歲之間,但20歲以前發(fā)病者較多,男女無差別,典型病例頭部CT及MRI雙側豆狀核區(qū)可見對稱性影像改變,血清銅藍蛋白顯著降低和尿銅排出量增高[6]。本文中疑似病例為青年男性,慢性起病,既往健康,否認遺傳病家族史,主要表現(xiàn)為錐體外系癥狀,無肝臟癥狀,但觸診時發(fā)現(xiàn)肝大,無脾大,腹部彩超證實肝大,未發(fā)現(xiàn)脾大。裂隙燈下查眼部未發(fā)現(xiàn)K-F環(huán)。從發(fā)病形式及臨床表現(xiàn)來分析高度懷疑肝豆狀核變性,但缺乏診斷依據(jù)。肝豆狀核變性為為數(shù)不多的治療有效的遺傳性疾病,若能獲得早期診斷,恰當?shù)拈L期系統(tǒng)驅銅治療,就可使患者享受與健康人一樣的生活和壽命。基因診斷被認為是早期確診WD的最佳方法。該病的致病基因為ATP7B基因,ATP7B已被定位于13q14.3區(qū)。近年來的研究證實中國患者的突變熱區(qū)為ATP7B8號外顯子的778密碼子[7,8]。筆者通過對疑似肝豆狀核變性患者及其母親、健康人的ATP7B外顯子進行基因測序的方法來證實此患者存在8號外顯子的基因突變,而此突變可能為導致發(fā)病的原因。在本文中,對病例組及對照組的ATP7B基因exon8進行PCR擴增產物測序結果顯示:對照組的ATP7B基因片段序列與從GenBank檢索到的序列完全一致;疑似肝豆狀核變性患者的第8外顯子存在純合Arg778Leu/G2333T錯義突變,同時伴隨Leu700Leu/C2310G同義突變;患者母親的ATP7B基因第8外顯子存在雜合的Arg778Leu/G2333T錯義突變,并伴隨Leu700Leu/C2310G同義突變。

根據(jù)獲得的ATP7B基因第8外顯子測序結果,推測其基因表達產物進行氨基酸比對結果顯示,可能存在Arg778Leu突變。而此突變可能為此患者發(fā)病的原因。

Arg778Leu位于ATP7B基因第8外顯子,該區(qū)編碼P型銅轉運ATP酶的第四跨膜功能區(qū)(即Tm4),此區(qū)域只要負責銅離子的轉運,Arg778Leu突變可能破壞該蛋白的一級、二級結構,影響Tm4的形成,使其功能喪失,若其他六個跨膜功能區(qū)仍具有功能,則其突變后果只能是削弱了銅的轉運。

綜上筆者對疑似肝豆狀核變性患者exon8進行檢測的方法來指導臨床診斷,進行早期干預。基因序列檢測對于基因快速篩選及早期快速確診具有重大意義。若能夠在發(fā)病早期或對高危人群進行診斷,降低患病率及死亡率。若能在產前進行診斷,則可以降低患兒的出生率,這對提高出生人口素質有極大推動作用。

[1]陳 源,耿江輝,張會豐.肝豆狀核變性分子生物學研究進展.臨床薈萃,2006,21(2):149.

[2]曹海燕,朱崇堯.肝豆狀核變性的首發(fā)癥狀與誤診[J].罕少疾病雜志,2002,9(5):24.

[3]趙啟華,賈云義.肝豆狀核變性隨訪 15年1例[J].罕少疾病雜志,2002,9(6):51.

[4]張國范,侯太輝,王 龍.33例青少年肝豆狀核變性誤診分析[J].罕少疾病雜志,2001,8(3):28.

[5]Yaize JG,Maitin P,Minox SJ,et al.Wilson discase:current status[J].Am J Med,2002,92:643.

[6]吳 江.神經病學.北京:人民衛(wèi)生出版社,2005,257.

[7]吳志英,王 檸,林珉婷,等.Wilson病基因全長外顯子的突變檢測利分析.中華神經科雜志,2001,34:152-153.

[8]趙 鵬,張本恕.肝豆狀核變性ATP7B基因Arg778Leu突變型與臨床表現(xiàn)的相關性研究.腦與神經疾病雜志,2007,15(2):104.

1007-4287(2010)01-0110-03

2009-03-08)